中华人民共和国国家标准GB 4789.34—2012食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定2012-05-17发布2012-07-17实施中华人民共和国卫生部发布 GB 4789.34—2012前言本标准代替 GB/T 4789.34-2008《食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验》。本标准与 GB/T 4789.34-2008相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了培养基和试剂；——删除了果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）测定和双歧杆菌的计数方法。I GB 4789.34—2012食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定12范围本标准规定了食品中双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）气相色谱仪配 FID检测器；c）冰箱：2℃～5℃；d）天平：感量 0.1 g；e）无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm；f）无菌吸管：1mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具 0.1mL刻度）或微量移液器（200 μL～1000 μL）及配套吸头；g）无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。3培养基和试剂3.1双歧杆菌培养基：见附录 A中的A.1。3.2PYG液体培养基：见附录A中的A.2。3.3甲醇：分析纯。3.4三氯甲烷：分析纯。3.5硫酸：分析纯（体积比）。3.6冰乙酸：分析纯（体积比）。3.7乳酸：分析纯。3.8乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1 mol/L。3.9乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。3.10乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1 mol/L。3.11乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。1 GB 4789.34—20124鉴定程序双歧杆菌鉴定程序见图 1。样品 25 g（mL）+225 mL灭菌生理盐水10倍系列稀释选择 2个～3个适当稀释度，各取 0.1 mL分别加入到双歧杆菌琼脂平板进行涂布厌氧，48 h36℃±1℃挑取菌落接种于双歧杆菌琼脂平板厌氧，48 h36℃±1℃革兰氏染色，过氧化氢酶试验接种 PYG液体培养基生化反应厌氧，48 h36℃±1℃测定乙酸、乳酸报告图1双歧杆菌鉴定程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。5.1.2以无菌操作称取 25 g（mL）样品，置于装有 225 mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。5.2稀释及涂布培养步骤2 GB 4789.34—20125.2.1用 1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用 1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100的样品匀液。5.2.2另取 1 mL无菌吸管或微量移液器吸头，按5.2.1操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用 1次1 mL灭菌吸管或吸头。5.2.3根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL稀释液，用L棒在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布,每个稀释度作两个平皿。置 36℃±1℃温箱内培养 48 h±2 h，培养后选取单个菌落进行纯培养。5.3纯培养挑取3个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36℃±1℃培养 48 h。5.4镜检及生化鉴定5.4.1涂片镜检双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。5.4.2生化鉴定过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌菌种主要生化反应见附录B。5.5有机酸代谢产物测定气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物,见附录C。6报告根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于 1（5.5），报告双歧杆菌属的种名。3