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GB_4789_13-2012食品微生物学检验_产气荚膜梭菌检验PDF

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文本描述
中华人民共和国国家标准GB 4789.13—2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验2012-05-17发布2012-07-17实施中华人民共和国卫生部发布 GB 4789.13—2012前言本标准代替 GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验》。本标准与 GB/T 4789.13—2003相比,主要变化如下:——修改了标准的中文名称;——修改了样品制备过程;——修改了培养基与试剂;——修改了操作步骤;——修改了菌数计算部分;——增加了附录 A。I GB 4789.13—2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验12范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的检验方法。本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:a)恒温培养箱:36℃±1℃;b)冰箱:2℃~5℃;c)恒温水浴箱:50℃±1℃,46℃±0.5℃;d)天平:感量 0.1 g;e)均质器;f)显微镜:10×~100×;g)无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL刻度)、10mL(具 0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头;h)无菌试管:18mm×180mm;i)无菌培养皿:直径 90 mm;j)pH计或pH比色管或精密pH试纸;k)厌氧培养装置。3培养基和试剂3.13.23.33.43.53.63.73.83.9胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂:见附录 A中A.1。液体硫乙醇酸盐培养基(FTG):见附录 A中A.2。缓冲动力-硝酸盐培养基:见附录 A中A.3。乳糖-明胶培养基:见附录 A中A.4。含铁牛乳培养基:见附录 A中A.5。0.1%蛋白胨水:见附录 A中A.6。革兰氏染色液:见附录 A中A.7。硝酸盐还原试剂:见附录 A中A.8。缓冲甘油-氯化钠溶液:见附录 A中A.9。4检验程序1 GB 4789.13—2012产气荚膜梭菌检验程序见图 1。检样25g(mL)检样+225 mL0.1%蛋白胨水均质、稀释10-1~10-6稀释液各1mL + TSC琼脂混合厌氧培养,36℃±1℃、20h~24h,黑色菌落计数任选黑色菌落 5个,分别接种FTG培养基确证试验镜检形态牛奶发酵动力- 硝酸盐乳糖-明胶报告图1产气荚膜梭菌检验程序5操作步骤样品制备5.15.1.1样品采集后应尽快检验,若不能及时检验,可在 2℃~5℃保存;如 8 h内不能进行检验,应以无菌操作称取 25 g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料),并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2以无菌操作称取 25 g(mL)样品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水(如为 5.1.1中冷冻保存样品,室温解冻后,加入 200 mL 0.1%蛋白胨水)的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质 1 min~2 min;或置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中,8 000 r/min~10 000 r/min均质1min~2 min,作为 1:10稀释液。5.1.3以上述 1:10稀释液按1 mL加0.1%蛋白胨水 9 mL制备10-2~10-6的系列稀释液。2 GB 4789.13—20125.2培养5.2.1吸取各稀释液 1 mL加入无菌平皿内,每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂(可放置于 50℃±1℃恒温水浴箱中保温)15 mL,缓慢旋转平皿,使稀释液和琼脂充分混匀。上述琼脂平板凝固后,再加 10 mL冷却至50℃的 TSC琼脂(可放置于50℃±1℃恒温水浴箱5.2.2中保温)均匀覆盖平板表层。5.2.35.2.4待琼脂凝固后,正置于厌氧培养装置内,36℃±1℃培养 20 h~24 h。典型的产气荚膜梭菌在 TSC琼脂平板上为黑色菌落。5.3确证试验5.3.1从单个平板上任选 5个(小于5个全选)黑色菌落,分别接种到FTG培养基,36℃±1℃培养18 h~24 h。5.3.2用上述培养液涂片,革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌,有时可见芽孢体。如果培养液不纯,应划线接种 TSC琼脂平板进行分纯,36℃±1℃厌氧培养20 h~24 h,挑取单个典型黑色菌落接种到 FTG培养基,36℃±1℃培养18 h~24 h,用于后续的确证试验。5.3.3取生长旺盛的 FTG培养液1 mL接种于含铁牛乳培养基,在46℃±0.5℃水浴中培养 2 h后,每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象,该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质,通常会上升到培养基表面。5 h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖,凝固酪蛋白并大量产气,呈“暴烈发酵”现象,但培养基不变黑。5.3.4用接种环(针)取 FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基,于36℃±1℃培养 24 h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况,判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长,无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加 0.5 mL试剂甲和0.2 mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者,表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不出现颜色变化,则加少许锌粉,放置 10 min,出现红色者,表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。5.3.5用接种环(针)取 FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基,于36℃±1℃培养 24 h,观察结果。如发现产气和培养基由红变黄,表明乳糖被发酵并产酸。将试管于 5℃左右放置1 h,检查明胶液化情况。如果培养基是固态,于 36℃±1℃再培养 24 h,重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖,使明胶液化。6结果与报告6.1典型菌落计数选取典型菌落数在 20 CFU~200 CFU之间的平板,计数典型菌落数。如果:a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在 20CFU~200CFU之间,计数该稀释度平板上的典型菌落;b)最低稀释度平板的典型菌落数均小于 20 CFU,计数该稀释度