中华人民共和国国家标准GB 4789.13—2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验2012-05-17发布2012-07-17实施中华人民共和国卫生部发布 GB 4789.13—2012前言本标准代替 GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验》。本标准与 GB/T 4789.13—2003相比，主要变化如下：——修改了标准的中文名称；——修改了样品制备过程；——修改了培养基与试剂；——修改了操作步骤；——修改了菌数计算部分；——增加了附录 A。I GB 4789.13—2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验12范围本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）冰箱：2℃～5℃；c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃；d）天平：感量 0.1 g；e）均质器；f）显微镜：10×～100×；g）无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头；h）无菌试管：18mm×180mm；i）无菌培养皿：直径 90 mm；j）pH计或pH比色管或精密pH试纸；k）厌氧培养装置。3培养基和试剂3.13.23.33.43.53.63.73.83.9胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录 A中A.1。液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录 A中A.2。缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录 A中A.3。乳糖-明胶培养基：见附录 A中A.4。含铁牛乳培养基：见附录 A中A.5。0.1%蛋白胨水：见附录 A中A.6。革兰氏染色液：见附录 A中A.7。硝酸盐还原试剂：见附录 A中A.8。缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录 A中A.9。4检验程序1 GB 4789.13—2012产气荚膜梭菌检验程序见图 1。检样25g(mL)检样+225 mL0.1%蛋白胨水均质、稀释10-1～10-6稀释液各1mL + TSC琼脂混合厌氧培养，36℃±1℃、20h～24h，黑色菌落计数任选黑色菌落 5个，分别接种FTG培养基确证试验镜检形态牛奶发酵动力- 硝酸盐乳糖-明胶报告图1产气荚膜梭菌检验程序5操作步骤样品制备5.15.1.1样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在 2℃～5℃保存；如 8 h内不能进行检验，应以无菌操作称取 25 g（mL）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。5.1.2以无菌操作称取 25 g（mL）样品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水（如为 5.1.1中冷冻保存样品，室温解冻后，加入 200 mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质 1 min～2 min；或置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8 000 r/min～10 000 r/min均质1min～2 min，作为 1:10稀释液。5.1.3以上述 1:10稀释液按1 mL加0.1%蛋白胨水 9 mL制备10-2～10-6的系列稀释液。2 GB 4789.13—20125.2培养5.2.1吸取各稀释液 1 mL加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于 50℃±1℃恒温水浴箱中保温）15 mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。上述琼脂平板凝固后，再加 10 mL冷却至50℃的 TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱5.2.2中保温）均匀覆盖平板表层。5.2.35.2.4待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36℃±1℃培养 20 h～24 h。典型的产气荚膜梭菌在 TSC琼脂平板上为黑色菌落。5.3确证试验5.3.1从单个平板上任选 5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18 h～24 h。5.3.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。如果培养液不纯，应划线接种 TSC琼脂平板进行分纯，36℃±1℃厌氧培养20 h～24 h，挑取单个典型黑色菌落接种到 FTG培养基，36℃±1℃培养18 h～24 h，用于后续的确证试验。5.3.3取生长旺盛的 FTG培养液1 mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃±0.5℃水浴中培养 2 h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5 h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。5.3.4用接种环（针）取 FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养 24 h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加 0.5 mL试剂甲和0.2 mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置 10 min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。5.3.5用接种环（针）取 FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃±1℃培养 24 h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于 5℃左右放置1 h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，于 36℃±1℃再培养 24 h，重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。6结果与报告6.1典型菌落计数选取典型菌落数在 20 CFU～200 CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在 20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于 20 CFU，计数该稀释度