ICS65.120 DB13 B 46 河北省地方标准 DB13/T 1384.9—2011 饲料中伊维菌素的测定 Determination of tylosin in feed 2011-05-10发布 2011-05-20实施 河北省质量技术监督局发 布  DB13/T 1384.9—2011 前言 本标准按照GB/T1.1－2009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、石家庄市疾病预防控制中心、河北医科大学、 北京出入境检验检疫技术中心、河北省饲料产品质量监督检验站。 本标准主要起草人：张岩、张宏、李挥、丛斌、卢晓宇、吕品、杨立学、李志平、贾茜、马春玲、 米振杰、张敬轩、沈磊、高振同、武英利。 I  DB13/T 1384.9—2011 饲料中伊维菌素的测定 1范围 本标准规定了饲料中伊维菌素的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料中伊维菌素的测定。 本标准的方法检出限为10μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682－1992，neq ISO 3696:1987) 3原理 试样中的伊维菌素，采用丙酮-水提取。提取液经用异辛烷进行液-液分配使被测物进入异辛烷层。 浓缩，用正己烷与乙腈浸出，并进行第二次液-液分配使被测物进入乙腈层。浓缩，加水，使成水溶液。 水溶液再经 Sep－Pak小柱净化，用乙腈洗脱。洗脱液经蒸干，甲醇浸出并定容，溶液经液相色谱-串联 质谱定性定量检测。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682规定的一级水。 4.1丙酮：经高锰酸钾回流l h，重蒸馏。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3异辛烷：重蒸馏。 4.4正己烧：经氧化铝层析柱净化后，重蒸馏。 4.5甲醇：色谱纯。 4.6丙酮-水（1+1）。 4.7乙腈-水（1+1）。 4.8 C18Se－Pak小柱，或相当者：使用前用水进行预处理。 4.9伊维菌素标准品：纯度≥97％。 4.10伊维菌素标准储备液：准确称取0.1 g（准确至0.000 l g）的伊维菌素标准品于100 mL 容量瓶中，用少量的甲醇溶解，然后再用甲醇稀释至刻度，混匀。配制成伊维菌素浓度为1.0 mg/mL 的标准储备液。 4.11伊维菌素标准工作液：根据需要，准确移取适量标准储备液，用甲醇稀释成适当浓度的标准 工作液，标准工作液需每周配制一次。 4.12甲酸。 1  DB13/T 1384.9—2011 4.130.1％甲酸水溶液：准确量取1 mL甲酸至1000mL容量瓶中，用水定容，混匀即可。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2电子天平：感量精确至0.01 g。 5.3离心管：50mL。 5.4离心机。 5.5旋转蒸发器。 5.6超声波浴。 5.7旋涡混匀器。 6测定步骤 6.1提取 称取约5 g（精确至0.0l g）试样于烧杯中，加入10 mL丙酮-水（1+1），旋涡混匀2min。移至 50 mL离心管中，用20mL异辛烷洗涤烧杯，合并入离心管中。旋涡混匀1 min，于5000 r/min离心 10min，取异辛烷层氮吹至2 mL。 6.2净化 取上述浓缩液加入8mL正己烷和10 mL乙腈，于超声波浴中超声振摇5 min。移至50mL离心管 中，于5 000r/min离心5 min。移乙腈层于50mL离心管中。再用10 mL乙腈提取一次，离心5 min， 合并乙腈层。加入20mL水，于60℃旋转蒸发浓缩至约6mL，加入6mL水。 取上述溶液缓慢注入经预处理过的C18Sep－Pak小柱中，弃去流出液，减压干燥。用3×5mL乙腈 洗脱，收集洗脱液于具塞刻度离心管中。氮气吹干，用1.0 mL甲醇－乙腈－水溶液（9+9+2）溶解， 待测。 6.3测定 6.3.1液相色谱-串联质谱条件 色谱柱：C18，5μm，150mm×4.6mm（内径）或相当者。 流动相：甲醇（A）+0.1% 甲酸水溶液（B）。 流速：0.8 mL/min。 梯度：见表1。 柱温：40℃。 进样量：20 μL。 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：负离子扫描。 检测方式：多反应监测。 电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。 定性离子对(m/z)：897.4/753.1，897.4/609.1。 定量离子对(m/z)：897.4/753.1。 2  DB13/T 1384.9—2011 表1梯度洗脱程序 时间（min） 0 A（％） B（％） 60 60 90 95 10 10 60 60 40 40 10 5 1.00 2.00 11.00 11.10 12.50 12.60 15.00 90 90 40 60 6.3.2色谱测定 根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液 中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。伊维菌素标准品多反应监测（MRM）色谱图见附录 A。 6.4定性、定量 按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准品 一致，定量测定时采用标准曲线法。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允 许偏差不超过表 2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/(％) ＞50 ±20 ＞20至50 ±25 ＞10至20 ±30 ≤10 ±50 允许的相对偏差/(％) 6.5空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 7结果计算和表述 用色谱数据处理机或用标准曲线按式（1）计算试样中伊维菌素含量： c×V X = m×1000 ……………………………………….(1) 式中： X一一试样中伊维菌素的量，单位为毫克每千克（mg/kg）。 c 一一从标准曲线上得到的待测液中伊维菌素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。 V——样液最终定容体积，单位