ICS65.120 DB13 B 46 河北省地方标准 DB13/T 1384.5—2011 饲料中庆大霉素的测定 Determination of Gentamycin in feed 2011-05-10发布 2011-05-20实施 河北省质量技术监督局发 布  DB13/T 1384.5—2011 前言 本标准按照GB/T1.1－2009给出的规则起草。 本标准由河北省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：河北省食品质量监督检验研究院、石家庄市疾病预防控制中心、河北省医科大学、 北京出入境检验检疫局技术中心、河北省饲料产品质量监督检验站。 本标准主要起草人：张岩、杨立学、李挥、丛斌、卢晓宇、吕品、张宏、贾茜、米振杰、沈磊、范 斌、李志平、高振同、武英利。 I  DB13/T 1384.5—2011 饲料中庆大霉素的测定 1范围 本标准规定了饲料中庆大霉素的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于饲料中庆大霉素的测定。 本标准的方法检出限为20μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682－1992，neq ISO3696:1987) 3原理 试样经提取，高速离心后再用 CBX固相萃取小柱净化，液相色谱串联质谱测定，子离子丰度比定 性，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2七氟丁酸酐（HFBA）：优级纯。 4.3三氯乙酸。 4.4磷酸二氢钾（KH2PO4）。 4.5盐酸。 4.6二水合乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。 4.7样品提取液（10 mmol/L KH2PO4溶液，含0.4 mmol/L EDTA和2％三氯乙酸）：准确称量1.36 g KH2PO4于1000 mL容量瓶中，加入少量水，用盐酸调pH至4.0，再加入1.5g Na2EDTA·2H2O和 20g三氯乙酸，用水定容至刻度，混匀即得。 4.8氢氧化钠。 4.9庆大霉素标准品：纯度≥99%。 4.10庆大霉素标准储备溶液：分别称取经折算相当于0.010 0 g新霉素的标准品，用水溶解定容至 100mL，溶液浓度为100 g/mL。1℃～4℃冷藏保存，保存期1个月。 4.11空白样品提取液：用不含链霉素的样品，按照6.1和6.2制备空白样品溶液。 4.12庆大霉素标准工作溶液：根据需要用空白样品溶液将标准储备液稀释成15 ng/mL、25ng/mL、 50ng/mL、250 ng/mL、300ng/mL的混合标准工作溶液，相当于样品中含有6g/kg、10g/kg、20g/kg、 100g/kg、120g/kg新霉素，现配。 1  DB13/T 1384.5—2011 4.13 CBX阳离子交换柱，或相当者：500 mg，6mL。 4.14乙酸。 4.1510％乙酸甲醇溶液：准确量取10mL乙酸于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀即可。 4.16100mmol/L HFBA水溶液：准确量取6.5mL七氟丁酸酐，用水稀释至500mL（4℃避光保存 6个月）。 4.1720mmol/L HFBA水溶液：准确量取100 mmol/L HFBA溶液50mL，用水稀释至250 mL（4℃ 避光保存6个月）。 4.185mmol/L HFBA水溶液：准确量取20mmol/L HFBA溶液25mL，用水稀释至100 mL（4℃避 光保存6个月）。 4.1920mmol/LHFBA乙腈溶液：准确量取1.3mL七氟丁酸酐，用乙腈稀释至500mL（4℃避光保 存6个月）。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2微孔滤膜。 5.3 pH计。 5.4高速离心机。 5.5旋涡混匀器。 5.6固相萃取装置。 6测定步骤 6.1提取 准确称取样品1g（精确到0.01g）至10 mL离心管中，加样品提取液10mL，旋涡混匀10min， 12 000r/min离心10min，移出上清液。重复提取一次，合并上清液，调 pH至8.0，12000r/min离 心10 min，取上清液备用。 6.2净化 将上清液移入 CBX柱（使用前分别用5 mL甲醇、5mL水预处理，保持柱体湿润）。溶液以2.0mL /min的流速过柱，然后依次用水淋洗，减压抽干20 min。用10%乙酸甲醇溶液5 mL洗脱，收集洗脱液 于40℃下氮气吹干。用5 mmol/L HFBA水溶液0.5 mL溶解残渣，15 000r /min离心10 min，经0.22 μm滤膜过滤后，待测。 6.3测定 6.3.1液相色谱-串联质谱条件 色谱柱：C18，5 μm，50mm ×2.l mm（内径）或相当者。 流动相：20mmol/L HFBA水溶液（A）+20mmol/L HFBA乙腈溶液（B）。 流速：0.25 mL/min； 梯度：0 min～10.0 min5%～60%B，10.0 min～10.1min60%～5%B，10.1min～15.0min 5% B。 柱温：30℃。 2  DB13/T 1384.5—2011 进样量：10μL。 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子扫描。 检测方式：多反应监测。 电喷雾电压、碰撞电压等自动优化至最佳值。 定性离子对(m/z)：478.6/157.1，478.6/322.1。 定量离子对(m/z)：478.6/157.1。 6.3.2色谱测定 根据试样中被测样液的含量情况，选取响应值相近的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和样液 中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内。庆大霉素标准品多反应监测（MRM）色谱图见附录 A。 6.4定性、定量 按照液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与