中华人民共和国国家标准GB 5413.19—2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定National food safety standard Determination of free biotin in foods for infants and young children, milk and milk products 2010-03-26发布2010-06-01实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布 GB5413.19—2010前言本标准代替GB/T 5413.19-1997《婴幼儿配方食品和乳粉游离生物素的测定》。本标准附录A为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB 5413-1985、GB/T 5413.19-1997。?I GB5413.19—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）对游离生物素的特异性和灵敏性，定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的培养基中，微生物的生长与待测物质含量呈线性关系，根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质的含量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的二级水。4.1菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014。4.2生物素（d-Biotin或Vitamin H）标准品（C10H16N2O3S）：纯度≥99 %。4.3培养基4.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录 A。4.3.2乳酸杆菌肉汤培养基：见附录 A。4.3.3生物素测定用培养基：见附录 A。注：一些商品化合成培养基效果良好，商品化合成培养基按标签说明进行配制。4.4乙醇溶液（50 %）。4.5硫酸溶液（3 %）：量取 3mL硫酸加入到水中，定容至100 mL。4.6氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）：称取 20 g氢氧化钠溶于1000 mL水中。4.7氯化钠溶液（9 g/L）：称取 9.0 g氯化钠溶解于1000 mL水中，分装试管，每管10 mL。121℃灭菌 15 min。4.8标准溶液的制备4.8.1生物素标准贮备液（100 μg/mL）：称取生物素标准品（4.2）用乙醇溶液（4.4）定容至生物素浓度为 100 μg/mL，贮于冰箱中。4.8.2生物素标准中间液（1 μg/mL）：吸取 1 mL生物素标准贮备液（4.8.1），用乙醇溶液（4.4）定容至 100 mL。4.8.3生物素标准工作液（10 ng/mL）：吸取 1mL生物素标准中间液（4.8.2），用乙醇溶液（4.4）定容至 100 mL。4.8.4标准曲线工作液1 GB5413.19—2010分两个浓度，高浓度溶液的浓度为 0.2 ng/mL；低浓度溶液的浓度为 0. 1 ng/mL。从工作液中（4.8.3）吸取两次各 5 mL，用水分别定容到 250 mL和500 mL。注：所有标准溶液要储存于冰箱内。4.8.1、4.8.2、和 4.8.3保存期三个月，4.8.4临用前配制。5仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1天平：感量为 0.1 mg。5.2pH计：精度≤0.02。5.3分光光度计。5.4涡旋混合器。5.5离心机：转速≥2000转/分钟。恒温培养箱：36℃±1℃。冰箱：2℃～5℃。5.65.75.8无菌吸管：10 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器或吸头。瓶口分液器：0 mL～10 mL。锥形瓶：200 mL。5.95.105.115.125.135.145.15容量瓶（A类）：100mL，250 mL，500 mL。单刻度移液管（A类）：容量5 mL。漏斗：直径 90 mm。定量滤纸：直径 90 mm。试管：18mm×180 mm。注：玻璃仪器使用前，用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可）对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后在 200℃干热2 h。6分析步骤6.1接种菌悬液的制备6.1.1将冻干菌株（4.1）活化后，转接到乳酸杆菌琼脂培养基（4.3.1）中，36℃±1℃培养过夜。再转接 2～3代来增强活力。然后再将其从固体培养上转接到乳酸杆菌肉汤培养基（4.3.2）中培养。将乳酸杆菌肉汤中的培养液以 2000转/分钟离心 2 min～3 min，倾出上清液，加入 10 mL氯化6.1.2钠溶液（4.7），混匀，再离心 2 min～3 min，如此清洗 3次～4次，吸适量该菌悬液于 10 mL盐水（4.7）中，待测。6.1.3用分光光度计以氯化钠溶液（4.7）做空白，于 550nm波长下测菌悬液（6.1.2）的透光率，使其透光率在 60 %～80 %之间。6.2样品的处理6.2.1干粉样品称取一定量样品（精确至 0.0001 g）于 250 mL三角瓶中，该样品应含0.2 μg～0.5 μg生物素。继续6.2.3步骤。6.2.2液体样品吸一定量的液体样品于 250 mL三角瓶中，该样品应含0.2 μg～0.5 μg生物素。继续6.2.3步骤。6.2.3样品的提取2 GB5413.19—2010加入硫酸溶液（4.5）100 mL，121℃水解30 min，冷却后用氢氧化钠溶液（4.6）调节 pH至4.5±0.2，定量转到 250 mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用滤纸过滤，弃去最初的几毫升。吸取滤液5 mL，加入约 20 mL水，用氢氧化钠溶液（4.6）调pH为6.8±0.2,定量转到 100 mL容量瓶中，用水定容。6.3标准曲线的制作按表 1顺序加入水、标准曲线工作液（4.8.4）和生物素测定用