中华人民共和国国家标准GB 5413.14—2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定National food safety standard Determination of vitamin B12 in foods for infants and young children, milk and milk products 2010-03-26发布2010-06-01实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布 GB5413.14—2010前言本标准代替GB/T 5413.14-1997《婴幼儿食品和乳粉维生素B12的测定》。本标准与GB/T 5413.14-1997相比，主要变化如下：——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》。本标准附录A为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB 5413-1985、GB/T 5413.14-1997。I? GB5413.14—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillusleichmannii）对维生素 B12的特异性和灵敏性，定量测定出试样中维生素 B12的含量。在测定用培养基中供给除维生素B12以外的所有营养成分，这样微生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素 B12的含量相对应。以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中维生素 B12的含量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的二级水。4.1菌株：莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830。4.2维生素 B12 （Vitamin B12或 Cyanocobalamin）标准品：分子式C63H88CoN14O14P，纯度≥99%。4.3培养基4.3.1乳酸杆菌琼脂培养基：见附录 A。4.3.2乳酸杆菌肉汤培养基：见附录 A。4.3.3维生素 B12测定用培养基：见附录A。注：一些商品化合成培养基效果良好，商品化合成培养基按标签说明进行配制。4.49 g/L氯化钠溶液（生理盐水）称取 9.0 g氯化钠溶解于1000 mL水中，分装于具塞试管，每管10 mL。121℃灭菌15 min。4.5乙醇溶液：体积分数为 25 %。4.6无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.7无水偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）。4.8柠檬酸（含一个结晶水）（C6H8O7?H2O）。4.9标准溶液的制备4.9.1维生素 B12贮备液（10 μg /mL）：精确称取维生素 B12标准品（4.2），用乙醇溶液（4.5）定容至维生素 B12浓度为10 μg /mL。1 GB5413.14—20104.9.2维生素 B12中间液（100 ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）将 5.0mL维生素B12贮备液（4.9.1）定容至 500 mL。4.9.3维生素 B12工作液（1 ng/mL）：用乙醇溶液（4.5）将 5.0mL维生素B12中间液（4.9.2）定容至 500 mL。4.9.4标准曲线工作液：分别吸取两个 5 mL维生素B12工作液（4.9.3）于250mL和500mL容量瓶中，用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为 0.02 ng/mL；低浓度溶液的浓度为 0.01 ng/mL。注：所有标准溶液要储存于冰箱内。4.9.1、4.9.2和4.9.3保存期三个月，4.9.4临用前配制。5仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1天平：感量为 0.1 mg。5.2pH计：精度≤0.01。5.3分光光度计。5.4涡旋混合器。5.5离心机：转速≥2000转/分钟。恒温培养箱：36℃± 1℃。冰箱：2℃～5℃。5.65.75.8无菌吸管：10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器和吸头。瓶口分液器：0 mL～10 mL。锥形瓶：200 mL。5.95.105.115.125.135.145.15容量瓶（A类）：100mL，250 mL，500 mL。单刻度移液管（A类）：容量5 mL。漏斗：直径 90 mm。定量滤纸：直径 90 mm。试管：18 mm ×180 mm。注：准备玻璃仪器时，使用活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后要求在 200℃干热2 h。6分析步骤6.1测试菌液的制备6.1.1将莱士曼氏乳酸杆菌（ATCC 7830）的冻干菌株（4.1）活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基（4.3.1）上，36℃±1℃培养24 h。再转种 2代～3代来增强活力。置 2℃～5℃冰箱保存备用。每 15 d转种一次。6.1.2将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基（4.3.2）中，36℃± 1℃培养18 h～24 h，以2000转/分钟离心 2 min～3 min，弃去上清液，加入 10 mL生理盐水（4.4），混匀，再离心2min～3 min，弃去上清液，再加入 10 mL生理盐水（4.4），混匀。如前离心操作，弃去上清液。再加10 mL生理盐水（4.4），混匀。吸适量该菌悬液于 10 mL生理盐水（4.4）中，混匀制成测试菌液。6.1.3用分光光度计（5.3），以生理盐水（4.4）做空白，于 550 nm波长下测测试菌液（6.1.2）的透光率，使其透光率在 60 %～80 %之间。6.2试样的处理2 GB5413.14—20106.2.1称取无水磷酸氢二钠（4.6）1.3 g，无水偏重亚硫酸钠（4.7）1.0 g，柠檬酸（含一个结晶水）（4.8）1.2 g，用 100 mL水溶解。6.2.2称