中华人民共和国国家标准GB 5413.12—2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 B2的测定 National food safety standard Determination of vitamin B2in foods for infants and young children, milk and milk products 2010-03-26发布2010-06-01实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 发布 GB5413.12—2010前言本标准代替GB/T 5413.12-1997《婴幼儿食品和乳粉维生素B2的测定》。本标准与GB/T 5413.12-1997相比，主要变化如下：——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定》。——取消了方法一荧光分光光度法；——对原标准的结构进行了修改；——混合酶液中增加了酸性磷酸酶，以解决添加核黄素磷酸盐作为维生素B2强化剂的样品测定；——样品处理方法中增加了“避免强光照射”的注意点；——外标法定量采用多点标准曲线法；——在结果计算时明确样品中维生素B2含量以核黄素计；——增加附录A标准溶液的液相色谱图。本标准附录A为资料性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：——GB 5413-1985、GB/T 5413.12-1997。I? GB5413.12—2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定1范围本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 B2的测定方法。本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素 B2的测定。2规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。3原理试样在稀盐酸环境中恒温水解，酶解，经 C18反相色谱柱分离，用荧光检测器（Ex：462nm，Em：522 nm）检测，外标法定量。4试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682规定的一级水。4.1盐酸。4.2三水乙酸钠。4.3冰乙酸。4.4甲醇：色谱纯。4.5维生素 B2（核黄素）标准品：纯度≥99%。4.6盐酸（1+1）：量取 100 mL盐酸（4.1）缓慢倒入100 mL水中，混匀。4.7盐酸（0.1 mol/L）：吸取 9 mL盐酸（4.1），溶于1000 mL水中。4.8盐酸（0.01 mol/L）：吸取 0.1 mol/L 盐酸（4.7）50 mL，用水稀释并定容至 500 mL。4.9乙酸钠溶液（0.05 mol/L）：称取 6.80 g 三水乙酸钠（4.2），加 900 mL水溶解，用冰乙酸调pH值至 4.0～5.0，用水定容至1000 mL。经 0.45 μm微孔滤膜过滤。4.10乙酸钠溶液（2.0 mol/L）：称取 27.22 g 三水乙酸钠（4.2），用水溶解并定容至 100 mL。4.11混合酶溶液：称取 2.345 g木瓜蛋白酶（活力单位≥600 U/g）、1.175 g淀粉酶（活力单位≥4000U/g）和 1.000 g酸性磷酸酶（活力单位≥4000U/g），用水定容至 50 mL。临用前配制。4.12标准溶液1 GB5413.12—20104.12.1维生素B2标准储备液（250μg/mL）：称取 25mg（精确至 0.1 mg）维生素B2标准品（4.5），加入盐酸（4.6）2 mL，超声溶解后，立即用水转移并定容至 100 mL。置于棕色玻璃容器中在 0℃～4℃冰箱贮存，保存期为 3个月。4.12.2维生素B2标准中间液：准确吸取4.00 mL标准储备液（4.12.1），用水稀释并定容至100 mL，此溶液中维生素B2浓度为 10 μg/mL。临用前配制。维生素B2标准系列工作液：分别吸取维生素B2标准中间液（4.12.2）0.00mL、0.50 mL、4.12.31.00 mL、2.00 mL、5.00 mL、10.00 mL，用水溶解并定容至 100 mL。该标准系列浓度分别为 0.00 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL。临用前配制。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪，带有荧光检测器。5.2高压灭菌锅。5.3 pH计：精度为0.01。5.4组织捣碎机。5.5 0.45 μm微孔水相滤膜。5.6天平：感量1 mg和0.1 mg。6分析步骤6.1试样的处理称取5 g～10 g（精确至0.01 g）试样（如有必要，将试样放入捣碎机中捣碎；试样中含维生素B2 5 μg以上）于100 mL三角瓶中，加60mL 0.1 mol/L盐酸（4.7），充分摇匀，用棉花塞和牛皮纸封口，放入高压灭菌锅内，在121℃下保持30min，待冷却至40℃以下后取出，轻摇数次；用2.0mol/L乙酸钠溶液（4.10）调pH值至4.0左右，加入2.0 mL混合酶溶液（4.11），摇匀后，置于37℃培养箱中过夜；将酶解液转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，用定量滤纸过滤，取滤液再经0.45 μm滤膜（5.5）过滤，取滤液备用。注：操作过程应避免强光照射。6.2测定6.2.1参考色谱条件色谱柱：C18反相色谱柱（粒径 5 μm，250 mm ×4.6 mm）或同等性能的色谱柱。流动相：0.05 mol/L乙酸钠溶液（4.9）—甲醇（4.4）= 65＋35。流速：1.0 mL/min。检测波长：激发波长462 nm，发射波长522 nm。进样量：20 μL。6.2.2标准曲线绘制将维生素B2标准系列工作液（4.12.3）依次进行色谱测定（其标准样品色谱图参见附录 A中图A.1），记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6.2.3试液测定将试液进行色谱测定，从标准曲线中查得试液相应的浓度。2 GB5413.12—20106.2.4空白试验除不加试样外，按上述操作步骤进行。7分析结果的表述试样中维生素B2的含量按式（1）计算：c×V×