ICS67.120.30DB21B50辽宁省地方标准DB 21/ T1861.4—2010 水产生物种质检验技术规程 简单 重复序列扩增法Simple sequence repeat procedure to detect germplasm for aquaculture species2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发 布 DB21/ T1861.4 —2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准主要起草人：赫崇波、李宏俊、高祥刚、刘卫东、李云峰、鲍相渤。附录A为资料性附录。I DB21/ T1861.4—2010水产生物种质检验技术规程 简单重复序列扩增法1范围本标准规定了水产生物简单重复序列扩增法的术语定义、原理、试剂、仪器、取样、DNA提取、微卫星引物筛选、PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶检测产物、数据统计和水产生物种质检验分析评价。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.15-2008养殖鱼类种质检验 第 15部分 RAPD分析3术语定义下列术语定义适用于本标准。3.1简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)又称为微卫星，一般指基因组中由短的重复单元(一般为 1~6个碱基)组成的DNA串联重复序列。3.2聚合酶链式反应(PCR)一种分子生物学技术，指用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA 聚合酶催化下，在体外人工合成特异的 DNA 片段的过程，用于放大特定的 DNA片段。3.3脱氧核苷酸(DNA)脱氧核苷的磷酸酯。如 5′-脱氧腺苷酸(5′-dAMP)、5′-脱氧鸟苷酸(5′-dGMP)、5′-脱氧胞苷酸(5′-dCMT)1 DB21/ T1861.4—2010和 5′-脱氧胸腺苷酸(5′-dTMP)，体内常为 5′-磷酸酯。3.4等位基因（allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.5基因型（genotype）指特定座位的等位基因组成。3.6座位（locus）染色体上的位点。3.7等位基因频率（allele frequency）给定座位上某等位基因所占的比例。3.8遗传杂合度（heterozygosity）表示群体在某个座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.9平均遗传杂合度（average heterozygosity）表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.10 多态信息含量（PIC）在连锁分析中一个遗传标记多态性可提供的信息量的度量。它是一个亲本为杂合子，另一亲本为不同基因型的概率。现常用来衡量座位多态性高低的程度。3.11遗传距离（genetic distance）用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度 DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从 0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间2 DB21/ T1861.4—2010的亲缘关系将越远。遗传距离的计算方法有多种。3.12Nei氏遗传距离（Nei'sgenetic distance）Nei提出的从大量基因频率数据估计每个座位的平均密码子差数的统计方法。3.13邻近结合法聚类分析（Neighbor joining method，NJ）邻近结合法聚类分析（neighbor joining，简称 NJ）是在系统进化分析时基于某个基因的序列进行分析，通过碱基的变化和差异计算相互之间的进化关系的一种计算方法。4原理微卫星中重复单位的数目存在高度差异，但是微卫星的侧翼通常都是保守的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列设计引物将微卫星位点扩增出来。由于微卫星位点重复单元数量的变异，不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这就是微卫星标记的原理。5试剂5.1裂解液 按附录 A配制5.2三羟甲基氨基甲烷饱和酚(Tris饱和酚)5.3三氯甲烷5.4异戊醇5.5无水乙醇5.6溴化乙锭5.75.810×Tris 硼酸 (10×TBE)电泳缓冲液 按附录 A配制6?上样缓冲液5.9100 bp DNA分子量标记5.10冰乙酸5.11琼脂糖5.12核苷酸(RNA)酶3