ICS67.120.30DB21B50辽宁省地方标准DB 21/ T1861.1—2010 水产生物种质检验技术规程 同工酶电泳分析法Isozyme procedure to detect germplasm for aquaculture species2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发 布 DB21/ T1861.1—2010前言本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准主要起草人：刘卫东、赫崇波、高祥刚、李云峰、鲍相渤、李宏俊、苏浩。附录A、B、C均为资料性附录。I DB21/ T1861.1—2010水产生物种质检验技术规程 同工酶电泳法1范围本规程规定了水产动植物同工酶电泳分析所涉及的原理、试剂、仪器、设备、抽样、样品制备、电泳、染色和分析方法等。本规程适用于水产动植物品种内群体酶位点与等位基因分析以及遗传异质性分析。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1同工酶（isozyme）：同工酶是生物体内催化相同反应而一级结构不同的酶。2.2等位基因(allele)：基因的一种变异体。在一个二倍体个体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于父本和母本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。2.3平均遗传杂合度(average heterozygosity):H表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3 原理同工酶是具有同样功效酶基因的表达产物，由于其所带电荷的不同和分子大小、形状的不同，在电场和凝胶中出现各种同工酶组分不同的迁移率，经催化、染色、扫描，根据酶带迁移距离、数目进行分析比较，判定生物物种、种群的遗传特性。4 试剂除非另有说明，本规程所设计试剂均为分析纯。4.195%乙醇。4.2甘油。4.3 盐酸（HCl）4.4 氢氧化钠（NaOH）4.5硼酸。4.6柠檬酸。4.7 乙二胺四乙酸（EDTA）。4.8 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。4.9L-组氨酸。4.10 丙烯酰胺（Arc）。1 DB21/ T1861.1—20104.11乳酸。4.12 N’,N’-亚甲基双丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺（Bis）。4.13 四甲基乙二胺（TEMED）。4.14 过硫酸胺（AP）。4.15DL-苹果酸。4.16α-磷酸甘油钠。4.17 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.18 二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）。4.19 辅酶Ⅰ（NAD）。4.20 辅酶Ⅱ(NADP)。4.21 吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）。4.22 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）。4.23山梨醇。4.24DL-异柠檬酸三钠。4.256-磷酸葡萄糖酸钠。4.26α–乙酸萘酯。4.27β-乙酸萘酯。4.28丙酮。4.29 坚牢蓝RR盐。4.30 氨基黑10B。4.31 固定液：3份乙醇，1份甘油，5份蒸馏水，混合均匀。4.321mol/L盐酸：82.5ml比重1.19的浓盐酸，加蒸馏水至1000ml 。4.33 浓缩胶缓冲液（Tris-HClpH6.8）：三羟甲基氨基甲烷6.0g溶于 40ml蒸馏水中，用1mol/L盐酸调pH值致6.8，定容至100ml。4.34 分离胶缓冲液（Tris-HCl pH8.8）：三羟甲基氨基甲烷36.3g与 48.0ml 1mol/L盐酸混合后，蒸馏水定容至100ml。4.35 TG电极缓冲液(Tris-甘氨酸 pH8.3)：三羟甲基氨基甲烷3.0g与甘氨酸 14.4g用蒸馏水溶解并定容至 1L。4.36 Arc.Bis液：丙烯酰胺30g，N’,N’-亚甲基双丙烯酰胺或甲叉双丙烯酰胺0.8g，用蒸馏水溶解并定容到 100ml，用 0.2μm微孔滤膜抽滤，棕色瓶保存于4℃2 DB21/ T1861.1—20104.37 1.5％过硫酸胺：过硫酸胺 0.15g溶于10ml蒸馏水中，4℃保存，一周内使用。4.38 不连续聚丙烯酰胺凝胶：分离胶的浓度亦为2.5％～4％，浓缩胶的浓度亦为 7％～10％。将凝胶模具清洗安装好后，根据所需分离胶浓度，按照附录 A配制分离胶并混匀后，立即灌注到凝胶模具中，至胶面离板顶 3cm 处停止。立即用注射器在胶面顶部注入 0.5cm高的蒸馏水，使胶面平整，室温下聚合 40min。当水层和分离胶呈现出明显的界限时既表示分离胶聚合完成。排除胶顶部蒸馏水，用浓缩胶缓冲溶液冲洗分离胶顶部并将该缓冲溶液排除，将按照附录 B配制的浓缩胶灌入至距板顶3mm处，立即插入试样格（梳子），移除多余的凝胶液，室温下聚合 1.5h。4.391.5mol/LTris-HCl (pH8.0)：三羟甲基氨基甲烷181.71g，用HCl调节调节pH值至8.0，蒸馏水定容到 1L。4.401.5mol/LTris-HCl(pH9.5)：三羟甲基氨基甲烷181.71g，用HCl调节调节pH值至9.5，蒸馏水定容到 1L。4.41 0.1mol/L磷酸缓冲溶液：二水磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）51.6g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）14.2g，蒸馏水定容至 1L。4.42 40％的蔗糖溶液：40g蔗糖溶于100ml蒸馏水中。4.431％溴酚蓝：1g溴酚蓝溶于100ml蒸馏水中，定性滤纸过滤后装于滴瓶。4.42 染色液：常用同工酶染色液的配置方法见附录 C。5仪器与设备5.1 微量匀浆机： 转速 4000r/min。5.2 高速冷冻离心机：转速 15000r/min以上，冷冻温度为4℃。5.3多用电泳仪。5.4垂直版电泳槽。5.5 pH计：读数值 0.01.5.6微量进样器。5.7制胶模具。5.8染色缸。5.9 低温冰箱，冰室温度在-30℃以下。5.10恒温培养箱。5.11电子天平：感量为0.0001g。5.12照相机。5.13扫描仪。6 抽样3