ICS67.120.30DB21B50辽宁省地方标准DB 21/ T1861.3—2010 水产生物种质检验技术规程简单重复序列间区扩增法ISSR procedure to detect germplasm for aquaculture species2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发 布 DB21/ T1861.3—2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：赫崇波，李云峰，刘卫东，高祥刚，李宏俊，鲍相渤。I DB21/ T1861.3—2010水产生物种质检验技术规程 简单重复序列间区扩增法1范围本标准规定了水产生物简单重复序列间区扩增法（ ISSR）的原理、试剂和材料、仪器、采样、分析步骤、数据分析和结果分析。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBT 18654.15-2008 养殖鱼类种质检验 第 15部分：RAPD分析3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1聚合酶链式反应（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的 DNA片段的过程。3.2遗传多样性（genetic diversity）所有生物携带的遗传信息的总和。广义上是指种内或种间，表现在分子、细胞、个体三个水平的遗传变异度，狭义上则主要是指种内不同群体和个体间的遗传多态性程度。本标准采用其狭义概念。3.3等位基因（allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.4等位基因频率（allele frequency）给定座位上某等位基因所占的比例。3.5遗传杂合度（heterozygosity）表示群体在某个座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.6平均遗传杂合度（average heterozygosity）表示群体平均在各座位为杂合子的比例，用于衡量标记方式的信息含量程度。3.7多态信息含量（PIC）表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。3.81 DB21/ T1861.3—2010遗传距离（genetic distance）用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度 DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从 0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间的亲缘关系将越远。4原理简单重复序列间区扩增法 inter-simplesequencerepeat(ISSR)的基本原理是利用简单重复序列设计引物，即引物主要由 1~4个碱基组成的重复序列，通常在引物的3'端或 5'端加几个非重复的锚定碱基以保证引物与基因组 DNA中的SSR的 3′或 5′端结合。在 PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间 DNA片段进行PCR扩增。5试剂和材料5.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）饱和酚。5.2三氯甲烷：分析纯。5.3异戊醇：分析纯。5.4无水乙醇。5.520×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸 61.7g，EDTA 7.44g，加超纯水到 1L。5.6冰乙酸：分析纯。5.7琼脂糖：生化试剂。5.8核糖核酸（RNA）酶：生化试剂。5.9 蛋白酶 K（20 mg/mL）：生化试剂。5.10丙烯酰胺：分析纯。5.11甲叉双丙烯酰胺：分析纯。5.12过硫酸铵：分析纯。5.13硝酸银（AgNO3）：分析纯。5.14四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯。5.15无水碳酸钠：分析纯。5.16Taq DNA聚合酶（生化试剂，5U/?L）。5.17标准分子量 Markers（100bp）。5.18硝酸：分析纯。5.1937%甲醛溶液。5.20乙二胺四乙酸（EDTA）。20%凝胶储存液：丙稀酰胺 38.6g，双丙稀酰胺 1.34g，20×TBE缓冲液10mL，加超纯水到 200mL。5.22上样缓冲液：98％甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.01％溴酚蓝及二甲苯青。0.1mol/L硫代硫酸钠：将2.48g 硫代硫酸钠（Na2S2O3?5H2O 溶于 100 ml超纯水中。5.215.23）5.24银染液：1g硝酸银溶于1L超纯水中，加入37%甲醛溶液 1.5ml。5.25显影液：3g碳酸钠溶于超纯水中，加入37%甲醛溶液 1.5ml和0.1mol/L硫代硫酸钠150μl。2 DB21/ T1861.3—20106仪器6.1凝胶成像分析系统6.2PCR仪6.3低温高速离心机6.5稳压稳流电泳仪6.7单道可调移液器（2.5?L，10?L，20?L，100?L，200?L，1000?L）6.8电子天平（量程 0.01-300mg）6.9水浴恒温震荡器6.10电泳槽6.11普通离心机6.12紫外分光光度计6.13超声波清洗器6.14超纯水器6.15北京六一仪器厂 DYY-Ⅲ型电泳仪7采样7.1样品类型7.1.1Ⅰ型：毛发、皮毛类（儒艮、中华白海豚、斑海豹、海龟）；7.1.2Ⅱ型：肌肉、肝脏组织类（仿刺参、海胆、虹鳟、大菱鲆、鳗鲡、中国对虾、日本对虾、中华绒鳌蟹、三疣梭子蟹、皱纹盘鲍、海湾扇贝、虾夷扇贝、栉孔扇贝、文蛤、牡蛎、海蜇等）；7.1.3Ⅲ型：藻类（海带、裙带菜、鼠尾藻等）。7.2采样方法7.2.1珍稀濒危动物采样应在自然保护机