ICS67.120.30DB21B50辽宁省地方标准DB 21/ T1861.2—2010 水产生物种质检验技术规程 扩增片段长度多态性法AFLP procedure to detect germplasm for aquaculture species2010-12-31发布2011-02-01实施辽宁省质量技术监督局发 布 DB21/ T1861.2—2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准归口单位：辽宁省海洋与渔业厅。本标准主要起草人：刘卫东、高祥刚、赫崇波、李云峰、李宏俊、鲍相渤。附录A、B、C均为资料性附录。I DB21/ T1861.2—2010扩增片段长度多态性法扩增片段长度多态性法1范围本标准规定了水产生物扩增片段长度多态性分析（AFLP）的原理、试剂、仪器和设备、采样、分析步骤和数据运算方法。本标准适用于水产生物种质检测与鉴定等方面的种质检验工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18654.15-2008 养殖鱼类种质检验 第15部分：RAPD分析3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1聚合酶链式反应（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的 DNA片段的过程。3.2基因型（Genotype）控制某一性状的基因组合。3.3座位（Locus）基因在染色体上所处的特定位置。3.4等位基因（Allele）基因的一种变异体，在二倍体细胞内每个基因有两个等位基因，每个等位基因分别来自于各自的亲本。在一个群体中一个基因可能有许多等位基因。3.5多态性位点百分率(Percent of Polymaorphic Loci，P)表示后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。3.6Nei’s 基因多样性指数（Gene Diversity，H）随机选择基因间的非同一的概率。3.7遗传距离（Genetic Distance，D）1 DB21/ T1861.2—2010用基因频率的函数表示的群体间遗传差异，它的最适宜的测度是单位长度 DNA的核苷酸数或密码子的差数，是用来表示群体或个体之间遗传关系远近的一个量化指标，其值可以从 0至无限大。群体或个体间的遗传距离越小，它们之间的亲缘关系越近，反之群体或个体间的遗传距离越大，那么它们之间的亲缘关系将越远。3.8Shannon多样性指数(Shannonindex，I)用来估算群落多样性的高低。3.9聚类分析（Cluster Analysis）将研究对象分为相对同质的群组（clusters）的统计分析技术。4原理扩增片段长度多态性法（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）的原理是对基因组总DNA酶切后经PCR进行选择性扩增，先将基因组DNA用两种限制性内切酶酶切成大小不等的片段，并与含有粘性末端的人工接头相连，形成酶切位点不同的限制性酶切片段，然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增，预扩增产物作为进一步PCR扩增的模板，再选用特异引物进行选择性扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。由于不同来源DNA的酶切片段存在差异，因而产生了扩增产物的多态。5试剂5.1三羟甲基氨基甲烷（Tris）饱和酚。5.2三氯甲烷：分析纯。5.3异戊醇：分析纯。5.4无水乙醇：分析纯。5.520×TBE缓冲液：三羟甲基氨基甲烷121g，硼酸 61.7g，EDTA 7.44g，加超纯水到 1L。5.6冰乙酸：分析纯。5.7琼脂糖：生化试剂。5.8核糖核酸（RNA）酶：生化试剂。5.9 蛋白酶 K（20 mg/mL）：生化试剂。5.10丙烯酰胺：分析纯。5.11甲叉双丙烯酰胺：分析纯。5.12过硫酸铵：分析纯。5.13硝酸银（AgNO3）：分析纯。5.14四甲基乙二胺（TEMED）：分析纯。5.15无水碳酸钠：分析纯。5.16Taq DNA聚合酶（生化试剂，5U/?L）。5.17标准分子量 Markers（100bp）。5.18硝酸：分析纯。5.1937%甲醛溶液。5.20乙二胺四乙酸（EDTA）：分析纯。2 DB21/ T1861.2—20105.21限制性内切酶：EcoRⅠ、MseⅠ。5.2220%变性凝胶储存液：丙稀酰胺 38.6g，双丙稀酰胺1.34g，尿素 86g，20×TBE 缓冲液 10mL，加热溶解，超纯水定容到 200mL后，用0.25μm的微孔滤膜抽滤，放置棕色瓶中4℃保存。5.23 上样缓冲液：98％甲酰胺，10mM EDTA(pH8.0)，0.01％溴酚蓝及二甲苯青。5.240.1mol/L硫代硫酸钠：将2.48g 硫代硫酸钠（Na2S2O3?5H2O 溶于 100 ml超纯水中。）5.25 银染液：1g硝酸银溶于1L超纯水中，加入37%甲醛溶液 1.5ml。5.26显影液：3g碳酸钠溶于超纯水中，加入 37%甲醛溶液 1.5ml和0.1mol/L硫代硫酸钠150μl。6仪器和设备6.1凝胶成像分析系统。6.2梯度 PCR仪。6.3低温高速离心机。6.4普通离心机。6.5稳压稳流电泳仪。6.6单道可调移液器（2.5 ?L，10 ?L，20 ?L，100 ?L，200 ?L，1000 ?L）。6.7电子天平（量程 0.01-300 mg）。6.8水浴恒温震荡器。6.9电泳槽。6.10冷冻离心机。6.11紫外分光光度计。6.12超声波清洗器。6.13超纯水器。6.14北京六一仪器厂 DYY-Ⅲ型电泳仪。6.15测序凝胶电泳槽。7采样7.1样品类型7.1.1I型样品：毛发、皮毛类（儒艮、中华白海豚、斑海豹、海龟）。7.1.2Ⅱ型样品：肌肉、脏器组织类（