D B 1 2天津市 地 方 标准茄子种子纯度S S R分子标记鉴定方法Method of identifyingseed purity of eggplant by using SSR-basedmarker本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科本标准主要起草人：兰青阔、王利英、赵新、王成、兰璞、乔军、刘婧、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。茄子种子纯度 S S R分子标记鉴定方法本标准规定了茄子种子纯度 SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。本标准适用于茄子单交种的纯度鉴定。下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 3543.2农作物种子检验规程扦样下列术语和定义适用于本文件。种子纯度seedpurity种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子聚合酶链式反应polymerasechainreaction (PCR)一种在体外通过酶促反应扩増特异 DNA片段的技术。3.3简单重复序列simplesequencerepeat (SSR)由几个核苷酸（1?6个 ）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个 bp(—般为100?200)的串联SSR分布于茄子整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用 PCR技术将多态的SSR扩増出来，通过电泳检测扩増产物，利用电泳图谱进行茄子种子纯度鉴定。PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000 V，400mA，400W) ; 万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-Na2 ) ；三羟甲基氨基甲烷（Tris ) ；盐 酸 （HCl，36%)；十二烷基硫酸钠 （SDS)；氯化钠（NaCl) ；氢氧化钠（NaOH) ；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（ TEMED ) ；过硫酸铵;冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（ 37% )；Taq DNA聚合酶（含Mg2+的10XPCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs ) ；SSR引物；琼脂糖 ；Gold View染料；定性PCR试剂盒；DNA提取试剂盒；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。检测样品的分样和保存，应符合 GB/T3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料各10份。在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h 35°C 光照培养，8h28°C暗培养，待种子长出子叶后备用。取单株幼苗子叶，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5 mL离心管中。将 DNA提取液预热到65 °C ，每管放入400混合样品，将离心管置于65°C 金属浴或水浴锅中，保温30 min后取下，向离心管中加入400pL 24:1氯仿-异戊醇（ V:V)，振荡混匀。10 000 g离心10min 。将上清液200 pL转入另一支1.5mL离心管，加入400pL -20 °C 预冷无水乙醇沉淀 DNA。10 000g离心1 min，弃上清液，加入500 pL乙醇— 乙酸铵溶液，6000g离心5 min收集沉淀。加入100pLTE (pH8.0)溶液溶解DNA。将DNA适当稀释或浓缩，使其OD26。值在0.1?0.8的区间内，测定并记录其在260nm和280 nm的吸光度。以1个OD26。值相当于50mg/L DNA浓度来计算纯化 DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测 DNA完整性。DNA溶液的OD260/OD280值应在1.7?2.0之间，或质量能复合检测要求。用15对核心引物进行 PCR反应，扩増双亲及送检样品各10份DNA，筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度鉴定的 SSR分子标记。总体积10