ICS65. 020. 01 DB21B20 辽 宁省地方标准DB 21/ T2339—2014百合鳞片组织培养扩繁技术规程2014 -07 -05发布2014 -09 -05实施辽宁省质量技术监督局发布 DB21/ T2339—2014 前言本标准按照GB/T 1.1-2009规则编写。本标准由沈阳市质量技术监督局归口。本标准起草单位：沈阳市农业科学院、铁岭市农产品质量安全检验检测中心。本标准主要起草人：李明艳、迟东明、左丽君、岳玲、宋伟、果朋忠、马东梅、李金凤、张家旺、徐丹、姚斌。I DB21/ T2339—2014 百合鳞片组织培养扩繁技术规程1 范围本标准规定了辽宁省百合鳞片组培生产环境的消毒灭菌、培养条件调控以及组培苗接种、继代、生根、移栽等的技术操作程序，并对其生产、试验设备、设施提出了具体要求本标准适用于辽宁省百合组培苗工厂化生产。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB 4285-89 农药安全使用标准GB/T8321 （所有部分）农药合理使用准则NY/T2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程3 定义下列定义适用于本标准。3.1 植物组织培养从植物体分离出符合需要的器官、组织或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。3.2 植体由活植物体上切取下来以进行培养的器官、组织或细胞、原生质体。3.3 培养基供植物外植体存活和生长所必需的介质，通常由水、无机盐、有机物质、凝固剂、糖以及植物生长调节物质等组成。3.4 初代培养1 DB21/ T2339—2014 接种外植体后继代培养之前的培养。3.5 继代培养对来自于初代培养获得的芽、原球茎等，通过分离切割并更新培养基，使培养材料数量上增加，并得到无根的幼苗。3.6 生根培养把无根的幼苗转接到生根培养基中诱导生根，培养成生根苗的过程。3.7 炼苗在保护设施中，采取逐步通风、控温、遮光等措施，使幼苗适应外界环境的过程。4 生产设备（施）及化学试剂4.1 建筑设施设计组培实验室或小型组培工厂必须选择环境优静、无污染的地方并保证其生产过程中不对周围环境造成污染。实验室或小型组培工厂各部分的配置要合理，做到工作方便、使用安全、节省能源。房屋设计包括准备室、接种室、培养室、洗涤室、实验室、贮存室、温室，另外还可配置办公室、更衣室等。4.2 洗涤设备工厂化生产可选用自动或半自动洗瓶机，实验室或小型车间选用普通洗涤用具，如洗涤室水槽、塑料盆、塑料桶、塑料箱等，人工洗涤。另外配置干燥箱、晾瓶架等。4.3 灭菌设备高压蒸汽灭菌锅（大型卧式、中型立式、小型手提式））、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、微滤孔器等。4.4 灭菌剂选用酒精、氯化汞、次氯酸钠、高锰酸钾、甲醛、过氧乙酸、新洁尔灭、来苏水、抗菌素等。5 组培室消毒灭菌洗涤室每天用来苏水、过氧乙酸等喷洒地面，保持室内清洁。接种室接种前用紫外灯照射20min-30min，并定期(一般 7d)用高锰酸钾及甲醛混合薰蒸。培养室的消毒灭菌一般 7d左右用高锰酸钾2 DB21/ T2339—2014 及甲醛混合薰蒸，或用70％酒精喷雾消毒，也可选用广普性杀菌烟雾剂薰蒸。超净工作台接种前用紫外灯照射 20min-30min，并用 70％酒精喷洒台面，或用新洁尔灭擦拭台面；定期清洗超净工作台过滤膜以保证过滤膜清洁。培养基的消毒灭菌高温高压蒸汽消毒，通常在压力 1.1kg/cm2、温度121℃条件下保持，污染的瓶苗消毒灭菌用消毒锅高温高压消毒，然后再清洗培养容器。6 初代培养由于百合鳞茎材料生长在土中，受土壤微生物的影响，污染率相当高，为此外植体消毒要严加注意。所以应取鳞茎由外向内的第 2-5层鳞片，流水冲洗30分钟后用0.2%-0.5%的洗衣粉水浸 10min，在自来水下冲洗干净。然后用 75%酒精灭菌 30s，再用 0.1%的升汞溶液浸泡 8min，期间不断进行摇动，最后用无菌水冲洗 5-6次。沿鳞片周围切去 1mm，然后选取外层下部与鳞茎盘相连的部分为最佳外植体横切约为 1.0cm的小块。将消毒后的无菌鳞片小块接种到 MS+2.0mg/LBA+0.2mg/LNAA培养基中，置于 25±2℃，照光9-10h，光强 1200lx条件下培养。接种2周里，即有98%左右的鳞片切块在近轴或边缘上诱导，也会有淡黄色的不定芽原基呈环状突起，这些不定芽在 4周以后，可形成中间轴出小鳞茎，在小鳞茎基部发生一些粗壮的根。将幼苗切成 1.5-2cm长的片段，接种到诱导愈伤组织的培养基上。3周后叶子的基部、叶脉、叶缘上均可诱导出一团团淡黄色的愈伤组织。7 继代培养分化培养时，可用 MS+0.5mg/L BA +0.05mg/L NAA 培养基。将愈伤组织转移到分化培养基上，10周后，愈伤组织逐渐膨大，分化出许多大小不等的鳞茎。将小鳞茎分离出来以后，留下愈伤组织转移到相同的新鲜分化培养基中，一段时间后仍能分化出小鳞茎。8 生根培养将继代培养基中长势较好的百合鳞茎和鳞茎切块(纵切 4块)接种到1/2MS+0.4mg/LNAA+1.0g/L AC的生根培养基中。9 炼苗移栽9.1 温室消毒移栽前半个月，用 1%的甲醛溶液对温室进行熏蒸消毒；用石灰水或高锰酸钾溶液对地面消毒；用高锰酸钾溶液对工具浸泡消毒。9.2 炼苗长出 2-3片叶子的生根苗即可进行炼苗。先将生根苗连同容器一起置于移栽设施中，放置1周，然后打开瓶口再放置 2d-3d。9.3 移栽移栽前将组培苗先用 1000倍的多菌灵或百菌清浸泡 24h，使其充分吸收水分，然后用脱水机将其脱水至手握无水下滴即可用于移栽。移栽时小心取出生根苗，用清水洗去根部粘附的培养基,将幼苗根3