文本描述
中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖／犜２４８２ —２０１０马 铃 薯 丛 枝 植 原 体 检 疫 鉴 定 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳狆狅狋犪狋狅 狑犻狋犮犺犲狊’犫狉狅狅犿狆犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪２０１００１１０ 发 布２０１００７１６ 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 犛犖／犜２４８２ —２０１０前 言本 标 准 的 附 录 Ａ和 附 录 Ｂ 均 为 资 料 性 附 录。本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 标 准 由 中 华 人 民 共 和 国 辽 宁 出 入 境 检 验 检疫 局 、中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院 负 责 起 草。本 标 准 主 要 起 草 人 ：王 秀 芬 、赵 文 军 、刘伟 、彭 金 火 、牟 海 青 、周 铭 、朱 水 芳。本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 犛犖／犜２４８２ —２０１０马 铃 薯 丛 枝 植 原 体 检 疫 鉴 定 方 法１ 范 围本 标 准 规 定 了 马 铃 薯 丛 枝 植 原 体 的 检 疫 鉴 定方 法。本 标 准 适 用 于 所 有 进 境 种 薯 、商 品薯 、组 培 苗 和 脱 毒 苗 等马 铃 薯 种 质 中 马 铃 薯 丛枝 植 原 体 的 检 疫鉴 定。２ 原 理２．１ 学 名 和 分 类 地 位学 名 ：Ｐｏｔａｔｏ ｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ缩 写 ：Ｐ Ｗ Ｂ分 类 地 位 ：细菌 界 （Ｂａｃｔｅｒｉａ），硬壁菌 门 （Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ），柔膜菌 纲 （Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ），非 固 醇 菌 原体 目（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ），非固醇 菌 原 体 科 （Ａｅｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ），植原 体属 （犘犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪），三 叶 草 丛 蔟 组（Ｃｌｏｖｅｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ，１６Ｓｒ Ⅵ）。其 他 资 料 参 见 附 录 Ａ。２．２ 鉴 定 原 理马 铃 薯 丛 枝 植 原 体 的 分 子 生 物 学 特 性 为 本 标准 鉴 定 方 法 的 主 要 依 据。３ 仪 器 和 用 具３．１ 仪 器 设 备 ：ＰＣＲ仪 、超净 工 作 台 、电 泳 仪 、凝胶 成 像 分 析 仪 、冷 冻 离 心 机 、电子 天 平 （１／１０ ０００ ｇ）、计 、水 浴 锅 、振 荡 器 等。ｐＨ３．２ 用 具 ；可 调 移 液 器 （０ μＬ ～ ２０ μＬ 、２０ μＬ ～ ２００ μＬ 、２００ μＬ ～ １ ０００ μＬ ）及 相 关 吸 头 、研 钵 、离心 管（１．５ｍＬ 、１０ ｍＬ ）、ＰＣＲ管 （０．２ｍＬ ）、量 筒 、烧 杯 、镊 子 等。４ 试 剂４．１ 研 磨 液磷 酸 氢 二 钠 （Ｎａ２ＨＰＯ４）磷 酸 二 氢 钠 （ＮａＨ２ＰＯ４）０．１ｍｏｌ／Ｌ０．０３ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ１０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ （ｐＨ８．０）蔗 糖１０ ％ （质 量 浓 度）ＰＶＰ４０２％ （质量 浓 度）调 整 ｐＨ至 ７．６，然后 过 滤 除 菌。使 用 前 加 入 ０．１５％（质 量 浓 度 ）牛血 清 白 蛋 白 （ＢＳＡ ）和 １ ｍ ｍｏｌ／Ｌ抗 坏 血 酸 维 生 素 Ｃ。４．２ 犆犜犃犅缓 冲 液ＣＴＡＢ２％ （质量 浓 度）ＴｒｉｓＨＣｌ１００ ｍ ｍｏｌ／Ｌ （ｐＨ８．０）ＥＤＴＡ２０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ （ｐＨ８．０）氯 化 钠 （ＮａＣｌ）１．４ｍｏｌ／ＬＰＶＰ４０１％ （质量 浓 度）１ 犛犖／犜２４８２ —２０１０４．３ 其 他 试 剂苯 酚 、三 氯 甲 烷 、异戊 醇 、异 丙 醇 、乙醇 、琼 脂 糖 、溴化 乙 锭 、犜犪狇ＤＮＡ聚 合 酶 、１０ × ＰＣＲ缓 冲 液、ｄＮＴＰ液 （２．５ｍ ｍｏｌ／Ｌ ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）。５ 检 疫 鉴 定５．１ 犇犖犃提 取大 约 ０．３ ｇ 组织 （叶 柄 、叶 脉 、茎 ）在３ ｍＬ 预 冷研 磨 液 中 研 磨 ，将 粗 汁 液 转移 至 ２ ｍＬ微 量 离 心 管中 。４℃ 下 ４ ５００ ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ 。 将 悬 浮 液 转 至 新的 ２ ｍＬ离 心 管 中 。４℃ 下 １３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心１５ ｍｉｎ 。 去 掉 上 清 液 。在预 热 （５５℃ ）ＣＴＡＢ 缓 冲 液中 悬 浮 沉淀 ［少 量缓 冲 液（如ＣＴＡＢ缓 冲 液 （如 ６５０ μＬ ）］。 ５５℃ 下 孵 育 ３０ ｍｉｎ ，间 歇 颠 倒７５０μＬ１００ μＬ ）更 易 悬 浮 沉 淀 ， 然 后 加 入 剩 余 的ＣＴＡＢ混 匀 。 离 心 管 在 冰 上 冷 却 ３０ ｓ。 加入 ７５０ μＬ 三 氯 甲 烷 ∶ 异戊 醇 （２４ ∶ １ 体 积 比 ），涡 旋 振 荡 。４ ℃ 或 室温 下 １３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离 心 ４ ｍｉｎ 。 小 心 将 上 面 水 相 转 至 一 个 新的 １．５ ｍＬ离 心 管 中 。 加 入 １ 体 积预 冷 异丙 醇 ，涡 旋 振 荡 。 冰 上 孵 育 ４ ｍｉｎ 后 ４℃ 或 室 温 下 １３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ ｍｉｎ 。 去 掉 上 清 液 。 用 ５００μ７０ ％ （体 积 分 数 ）冷 乙 醇 洗 涤沉 淀 ，４ ℃ 或 室 温 下 １３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心 １ ｍｉｎ 。 空 气 干 燥 沉 淀 。ＬＤＮ ＡＤＮ Ａ用 ２０ μＬ 灭 菌 蒸 馏 水 悬浮 沉 淀 。５５ ℃ 下孵 育 离 心 管 １０
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