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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖／犜１１３５ ．５—２００７马 铃 薯 环 腐 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉 犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊 狊狌犫狊狆 ．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊２００７１２２４ 发 布２００８０７０１ 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜 １１３５ ．５—２００７前 言 ＳＮ／Ｔ１１３５ 共 分 为 五 个 部 分：——— 马 铃 薯 癌 肿 病 检 疫 鉴 定 方 法；——— 马 铃 薯 黄 化 矮 缩 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法；——— 马 铃 薯 帚 顶 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法；——— 马 铃 薯 黑 粉 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法；——— 马 铃 薯 环 腐 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法。本 部 分 是 ＳＮ／Ｔ１１３５ 的 第５ 部 分。本 部 分 的 附 录 Ｂ 、附 录均 为 规 范 性 附 录 ，附 录为 资 料 性 附 录。ＡＣ本 部 分 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 部 分 起 草 单 位 ：中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究院 、中 华 人 民 共 和 国 北 京 出 入 境 检 验 检 疫 局。本 部 分 主 要 起 草 人 ：赵 文 军 、陈 红 运 、梁新 苗 、张 乐 、朱 水 芳 、魏 梅 生。本 部 分 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜 １１３５ ．５—２００７马 铃 薯 环 腐 病 菌 检 疫 鉴 定 方 法１ 范 围ＳＮ／Ｔ１１３５ 的 本 部 分 规 定 了 马 铃薯 环 腐 病 菌 的 检 疫 鉴 定 方 法。本 部 分 适 用 于 所 有 进 出 境 马 铃 薯 种 薯 及 商 品用 薯 的 检 疫 和 鉴 定。２ 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 ＳＮ／Ｔ１１３５的 本 部 分。２．１双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定在 固 相 支 持 物 上 （酶 联 板 ）包 被 细 菌 特异 性 抗 体 ，加 入 待 测 样 品 后 ，再 用 酶 标 记 的 细 菌 抗 体 进 行 免 疫识 别 ，最 后 通 过 酶 促 化 学 反 应 检 测 细 菌 是否 存 在 的 一 种 血 清 学 检 测 方 法。２．２犘犆犚以 耐 热聚 合 酶 和 一 对 引 物 （与 待 测 目 标 核 酸分 子 序 列 同 源 的片 段 ）通 过 高 温 （ＤＮＡ分ＤＮ Ａ聚 合 酶 延 伸 ）交替 循 环 扩 增 待 测 目 标 核 酸 分ＤＮ Ａ子 变 性 ）和 低 温 （引 物 和 目 标 核 酸 分子 复 性 并 被 耐 热子 的 方 法。ＤＮ Ａ３ 原 理马 铃 薯 环 腐 病 菌 （犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉犿犻犮犺犻犵犪狀犲狀狊犻狊 ｓｕｂｓｐ ．狊犲狆犲犱狅狀犻犮狌狊），属厚 壁 菌 门 （Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）厚壁 细 菌 纲（Ｆｉｒｍｉｂａｃｔｅｒｉａ）棒形 杆 菌 属 （犆犾犪狏犻犫犪犮狋犲狉），依 靠 病 薯 进 行 远 距 离 传 播 。 寄 主 及 世 界 分 布 参 见 附 录 Ａ。４ 仪 器 和 用 具４．１ 仪 器 设 备仪 、超 净 工 作 台 、灭 菌 锅 、制 冰 机 、核酸 蛋 白 分 析 仪 、高 速 冷 冻 离 心 机 、台 式 小型 离 心 机 、超 低 温ＰＣＲ冰 箱 、常 规 冰 箱 、旋 涡 振 荡 器 、微 量进 样 器 、电 泳 仪 、凝 胶 成 像 系 统 、酶 标 仪。４．２ 主 要 试 剂除 另 有 规 定 外 ，所有 试 剂均 为 分 析纯 。 ＰＣＲ缓 冲 液 、氯化 镁 （ＭｇＣｌ２）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ 、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、犜犪狇 ＤＮ Ａ聚 合 酶 、引 物和 探 针 、牛 肉 汁 、酵母 膏 、磷 酸 氢二 钾 （Ｋ ２ＨＰＯ ４ ）、磷 酸 二 氢钾（Ｋ Ｈ ２ＰＯ ４）、硫酸 镁 （ＭｇＳＯ ４）、葡萄 糖 、琼 脂 ，酶 联 检 测 试 剂 见 附 录 Ｂ。５ 病 菌 的 鉴 定５．１ 症 状 检 查取 样 品 量 １％～５％（若 样 品 少 可 适 量 增 大 比 例 ）的 块 茎 进 行 检查 。 将 块 茎 横 切 ，检 查 环 腐 病 菌 侵 染症 状 ，挤 压 块 茎 ，检 查 维 管 组 织 是 否 浸解 。 发 病 轻 者 维 管 束 变 黄 ，呈 不 连 续 的 点 状 变 色 ；重 者 整 个 维 管 束环 变 色 。 病 菌 也 可 侵 害 块 茎 维 管 束 周 围 的 薄 壁 组织 ，呈 环 状 腐 烂 ，严 重 时 可 引 起皮 层 与 髓 部 组 织 分 离，轻 轻 挤 压 块 茎 从 维 管 束 中 涌 出 奶 酪 样 的 柱 状物 。 块 茎 表 面 的 症 状 在 轻 度 危 害 时 不 明 显 ，随 病 害 发 展 ，皮色 变 暗 或 变 褐 ，严 重 时 表 皮 可 出 现 裂 缝。５．２ 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定利 用 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 对 样 品进 行 初 筛 （见 附 录 Ｂ ），若 检 测 结 果 为 阳 性 ，需 进 行 病 原１ 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜 １１３５ ．５—２００７菌 的 分 离 培 养 及 ５．４方 法 测 定。５．３ 病 原 菌 的 分 离 培 养５．３．１ 培 养 基 的 制 备营 养 肉 汤 酵 母 膏 培 养 基 （ＮＢＹ）：牛 肉 汁 ８．０ ｇ，酵母 膏 ２．０ｇ，磷酸 氢 二 钾 （Ｋ ２Ｈ
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