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中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖／犜２３９８ —２０１０苹 果 丛 生 植 原 体 检 疫 鉴 定 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳犮犪狀犱犻犱犪狋狌狊狆犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪 犿犪犾犻２０１００１１０ 发 布２０１００７１６ 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 中 华 人 民 共 和 国 出 入境 检 验 检 疫行 业 标 准苹 果 丛 生 植 原 体 检 疫 鉴 定 方 法ＳＮ／Ｔ２３９８ —２０１０中国 标准出 版社 出版北 京 复 兴 门 外 三 里 河北 街 １６号邮 政 编 码 ：１０００４５网 址 ｗｗｗ．ｓｐｃ电 话 ：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中 国 标 准 出 版 社 秦 皇岛 印 刷 厂 印 刷开 本８８０ × １２３０ １／１６ 印 张０．７５ 字 数千 字１４２０１０ 年 ４ 月第 一 版 ２０１０ 年 ４ 月 第 一 次 印 刷印 数 １—１６００书 号 ：１５５０６６·２２０６９５ 定 价１６ ．００元 犛犖／犜２３９８ —２０１０前 言 本 标 准 部 分 采 用 ＥＰＰＯ 植 物 检 疫 标 准 （ＰＭ７／６２ （１）），主 要 技 术 差 异 如 下：——— 删 除 检测 方 法；ＥＬＩＳＡ——— 删 除 指 示 植 物 鉴 定 方 法；——— 添 加 电 子 显 微 镜 观 察 方 法。本 标 准 的 附 录 Ｂ 、附 录 Ｃ 、附 录 Ｄ 为 规 范 性附 录 ，附 录 Ａ 为 资 料 性 附 录。本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 标 准 负 责 起 草 单 位 ：中 国 检 验 检 疫 科 学研 究 院。本 标 准 参 加 起 草 单 位 ：中 华 人 民 共 和 国 北京 出 入 境 检 验 检 疫 局 、中 华 人 民 共 和 国 新 疆 出 入 境 检 验 检疫 局 、中 华 人 民 共 和 国 辽 宁 出 入 境 检 验 检疫 局。本 标 准 主 要 起 草 人 ：黄 新 、牟 海 青 、邓从 良 、杨 旭 光 、张 祥 林 、王 有 福 、朱 水 芳。本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 犛犖／犜２３９８ —２０１０苹 果 丛 生 植 原 体 检 疫 鉴 定 方 法１ 范 围本 标 准 规 定 了 苹 果 丛 生 植 原 体 的 检 疫 和 鉴 定方 法。本 标 准 适 用 于 进 出 境 苹 果 苗 木 及 接 穗 中 苹 果丛 生 植 原 体 的 检 疫 和 鉴 定。２ 原 理２．１ 分 类 地 位苹 果 丛 生 植 原 体（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ 犘犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪犿犪犾犻，Ａｐｐｌｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ，ＡＰ ），软 壁 菌门 ，柔 膜 菌 纲 ，不 需 固 醇 菌 原 体 目 ，不需 固 醇 菌 原 体 科 ，植 原 体 属 ，１６Ｓ ｒＸ 植 原 体 组 。２．２ 检 测 方 法其 生 物 学 特 性 和 基 因 序 列 等 分 子 生 物 学 信 息是 该 检 疫 鉴 定 方 法 的 依 据。ＤＡＰＩ荧 光 染 色 方 法 操 作 简 便 、成 本 低 ，在 本标 准 中 作 为 一 种 初 步 筛 选 植原 体 的 方 法 ；ＰＣＲ技 术 灵敏 度 高 、特 异 性 好 ，ＲＦＬＰ 技 术 目 前 是 国 际上 植 原 体 鉴 定分 类 的 主 要 方法 ，在 本 标 准中 ＰＣＲ技 术 与ＲＦＬＰ技 术 结 合 作 为 鉴 定 苹 果 丛 生植 原 体 的 准 确 方 法。３ 器 材 和 试 剂ＰＣＲ仪 、超 净 工 作 台 、灭 菌 锅 、制 冰 机 、核酸 蛋 白 分 析 仪 、高 速 冷 冻 离 心 机 ，台 式 小型 离 心 机 、超 低 温冰 箱 、常 规 冰 箱 、旋 涡 震 荡 器 、微 量进 样 器 、电 泳 仪 、凝 胶 成 像 系 统。ＤＡＰＩ、ＰＣＲ 缓 冲 液 、氯化 镁 、ｄＮＴＰ、犜犪狇 ＤＮ Ａ聚 合 酶 、引 物 等。４ 检 测 鉴 定 方 法４．１ 症 状 观 察仔 细 观 察 苹 果 种 苗 、果 实 、叶 片 等 ，症状 描 述 参 见 附 录 Ａ。４．２ 犇犃犘犐染 色选 取 幼 嫩 组 织 （新 叶 叶 梗 ，枝 梢 ，茎杆 及 根 部 韧 皮 部 组 织 ），切 片 ，用 １ μｇ／ｍＬＤＡＰＩ溶 液 （４’，６二脒基２苯基 吲 哚 ）染 色 ，在 ４６０ ｎｍ激 发 条 件 ，荧 光 显 微 镜 观 察 ，在 韧 皮 部 筛 管 部位 有 明 显 的 蓝 色 荧 光 信 号表 明 有 植 原 体 存 在 。 因 植 株 内 植 原 体 分 布 不 均 ，故每 个 样 品 需 选 取 不 同 部 位 的 幼 嫩 材 料 进 行 检 测。４．３ 通 用 引 物 犘犆犚凝 胶 电 泳 及 犚犉犔犘检 测通 用 引 物 ＰＣＲ凝 胶 电 泳 及ＲＦＬＰ检 测 见 附 录 Ｂ。４．４ 特 异 性 引 物 犘犆犚凝 胶 电 泳 检 测特 异 性 引 物 ＰＣＲ凝 胶 电 泳 检 测 见 附 录Ｃ。４．５ 植 原 体 形 态 观 察对 采 集 的 植 物 样 品 制 备 超 薄 切 片 ，通 过 电镜 观 察 植 原 体 形 态 方 法 见 附 录 Ｄ。５ 结 果 判 定５．１ 表 现 症 状 与Ａ ．１．１ 描 述 一 致 且ＤＡＰＩ染 色 观 察 结 果 显 示 蓝 色 荧 光 ，可初 步 判 定 为 苹 果 丛 生 植 原体 ，但 需 通 过 ５．２、５．３、５．４中 任 意
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