版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售! !!!!!! !!中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准! "!"#!"#$ !""%番 茄 黑 环 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法$%&'()*)+,()-'-*(-.,(-/0,+12)'34)256!""%7#!7!$发 布!""&7"%7"#实 施中 华人 民 共 和国国家质量技术监督检验检疫总局发布 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售!"!#!"#$"!""%前 !!言!!本 标 准 的 附 录!!附 录 "为 规 范 性 附 录"附 录 #!附 录 $为 资 料 性 附 录#本 标 准 由 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出 并 归口#本 标 准 起 草 单 位 $中 华 人民 共 和 国 天 津 出入 境 检 验 检 疫 局 !中华 人 民 共 和 国上 海 出 入 境 检 验检疫 局#本 标 准 主 要 起 草 人 $夏 惠 娟 !杨 翠 云 !刘 勇 !郭 京 泽!刘 鹏 !廖 芳 !罗 加 凤 !于 翠#本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准#! 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售!"!#!"#$"!""%番 茄 黑 环 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法#!范 围本 标 准 规 定 了 番 茄 黑 环 病 毒 检 疫 鉴 定 的 方 法 #本 标 准 适 用 于 所 有 进 出 境 活 体 植 物 材 料 "包 括无 性 繁 殖 材 料 !组 培 苗 !种 子 和 苗 木 中番 茄 黑 环 病 毒的 检 疫 鉴 定#!!术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准#!%#双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定在 固 相 支 持 物 上 %酶 联 板 &包 被 病 毒 特 异 性 抗 体 "加 入待 测 样 品 后 "再 用 酶 标 记 的 病 毒 抗 体 进 行 免 疫识 别 "最 后 通 过 酶 促 化 学 反 应 检 测 病 毒 是 否 存在 的 一 种 血 清 学 检 测 方 法#!%!$#%&'$利 用 反 转 录 酶 将 病 毒&'!反 转 录 为 ("'!"并 以耐 热 "'!聚 合 酶和 一 对 引 物 %与 待 测 目 标 核 酸"'!片 段 &通过 高 温 %"'!分子 变 性 &和 低 温 %引 物和 目 标 核 酸 分 子复 性 并 被 耐 热"'!聚 合 酶 延 伸 &交 替 循 环 扩增 待 测 目 标 核 酸 分 子 的 方 法#分 子 序 列 同 源 的&!原 理番 茄 黑 环 病 毒 学 名 ')*+,-*./,(0123452167%缩 写 $)#&8&(!分 类 地 位 $豇 豆 花 叶病 毒 科%$*+*52912:,;&"线 虫 传 多 面 体 病 毒 属%该 病 毒 主 要 通 过 介 体传 播 % 线 虫&#!"#$%&'()*$+,&-$'().//"+(./()和 *0"1$+,./()&!机 械 传 播!种 子 %繁 缕 和大 豆 等 &传 播 "也 可 通 过 无 性 繁 殖 材 料 的 运 输 等 进行 长 距 离 传 播#该 病 毒 粒 体 为 等 轴 多 面 体 病 毒 "直 径 约 为<=3+#该 病 毒 基 因 组 含 两 条 77&'!&'!9>长 ?%<@A0.&'!9B长 C%D>A0.%英 国 血 清 型 &和%德 国 血 清 型&##)C%DDB0.该 病 毒 的 血 清 学 !生 物 学 !分 子 生 物 学 和 粒 体 形态 等 特 性 是 鉴 定 该 病 毒 的 依 据#$!仪 器 设 备 和 设 施 !用 具 和 试 剂$%#!仪 器 设 备酶 标 仪 !电 子 天 平%*&!>>====4 E$&仪 !电 泳 仪 !电 泳 槽 !凝 胶 成像 系 统 !透 射 电 子 显 微 镜 !微 量 榨&!生 物 培 养 箱 %具 有 光 照 条 件 "温 度 可 控 制汁 机 !水 浴 锅 !低 速 离 心 机 %转 速 为**<===1+23"@===1+23范 围 为 =F"@=F&!高 速 冷 冻 离 心 机 !GA=F超低 温 冰 箱#$%!!设 施隔 离 温 室%>=F"<=F&$%&!用 具可 调 式 微 量 移 液 器 % &及 相 应 的 移 液 器 吸 头 ! 酶 联!!! !!B%@ H>= H>== HB== H>===H@=== H######板 !IJJ;3:*1K管 !研 钵 !JL计 或各 范 围 的 JL试 纸 条 !量 筒 !封 口 膜 !吸 水 纸 !白瓷 盘 及 镊 子 等#> 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售!"!#!"#$"!""%$%$!试 剂酶 联 反 应 检 测 试 剂 %见 附 录!&!摩 擦 接 种 检 测试 剂 %参 见 附 录 #&!免疫 电 镜 检 测 试 剂 %参见 附 录$&!&)9E$&检 测 试 剂 %见 附 录"&#'!病 毒 检 测采 用 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法 %见 附 录!&!摩 擦 接 种 检 测 方 法 %参 见 附 录 #&!免 疫电 镜 检 测检 测 方 法 %见 附 录 "&进 行 检 测#$ &)9E$&方 法 %参 见 附 录&!(!结 果 判 定(%#!样 品 酶 联 检 测 结 果 为 阴 性 "&)9E$&检测 也 为 阴 性 "判 定 为 不 携 带 番 茄 黑 环 病 毒#(%!!样 品 酶 联 检 测 为 阳 性 "出 现 任 何 一种 下 列 情 况 "均 可 判 定 为 携 带 番 茄 黑 环 病 毒$+++&)9E$&检 测 为 阳 性)+++摩 擦 接 种 检 测 "鉴 别 寄 主 反