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SNT_2125-2008李痘病毒检疫鉴定方法PDF

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文本描述
版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖/犜2125 —2008李 痘 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳 犘犾狌犿 狆狅狓 狏犻狉狌狊20080904 发 布20090316 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖/犜2125 —2008前    言    本 标 准 的 附 录为 资 料 性 附 录。A本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 标 准 起 草 单 位 :中 华 人 民 共 和 国 广 东 出入 境 检 验 检 疫 局 、中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院 动 植 物 检 疫 研究 所 、中 华 人 民 共 和 国 辽 宁 出 入 境 检 验 检疫 局。本 标 准 主 要 起 草 人 :陈 定 虎 、王 章 根 、李明 福 、胡 学 难 、李 桂 芬 、王 秀 芬 、冯 黎 霞 、管 维。本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖/犜2125 —2008李 痘 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 李 痘 病 毒 检 疫 和 鉴 定 的 基 本 原则 和 方 法。本 标 准 适 用 于 带 有 李 痘 病 毒 的 所 有 进 出 境 的无 性 繁 殖 材 料 、组 培 苗 、种 子 和 果 实 的 检 疫 鉴 定。2 原 理李 痘 病 毒 学 名 :Plumpox virus(PPV),别 名 :Sharka virus,是核 果 类 果 树 危 险 性 最 大的 病 毒 之 一,其 外 壳 蛋 白 的 特 异 性 和 核 酸 序 列 的 特 殊 性 是本 标 准 制 定 的 主 要 依 据 ;该 病 毒 的分 类 地 位 、地 理 分 布 、寄主 范 围 和 症 状 、传 播 途 径 、血 清 学 特 性及 基 因 组 特 征 等 参 见 附 录 A。3 仪 器 设 备 、用 具 及 试 剂3.1 仪 器 设 备3.1.1  酶 标 检 测 仪。扩 增 仪。3.1.2 PCR3.1.3  电 泳 仪。3.1.4  台 式 高 速 冷 冻 离 心 机。3.1.5  凝 胶 成 像 系 统。3.1.6  电 子 分 析 天 平。3.2 用 具3.2.1  移 液 器 (0.1 μL ~2μL ,2 μL ~10 μL ,10 μL ~100 μL ,100μL ~1 000 μL)。3.2.2  研 钵。3.2.3 0.2mL 、0.5mL 、1.5 mL3.2.4  酶 联 板。离 心 管。检 测 试 剂3.3 犈犔犐犛犃3.3.1  包 被 缓 冲 液 1 000 犿犔 (狆犎9.6)碳 酸 钠 (Na2CO 3)      1.59g碳 酸 氢 钠 (NaHCO3)叠 氮 化 钠 (NaN3)2.93 g0.2 g溶 于 1 000 mL蒸 馏 水 中 ,溶 液 的 pH为 9.6,不需 要 调 pH值。3.3.2 犘犅犛缓 冲 液 1 000 犿犔 (狆犎7.2~7.4)氯 化 钠 (NaCl)                      8g磷 酸 二 氢 钾 (K H 2PO4)磷 酸 氢 二 钠 (Na2HPO4·12H 2O)氯 化 钾 (KCl)0.2 g2.9 g0.2 g0.2 g叠 氮 化 钠 (NaN3)用 无 菌 水 溶 解 并 定 容 至 1 000 mL。3.3.3  样 品 抽 提 缓 冲 液 1 000 犿犔二 乙 基 碳 酰 二 胺 (DIE CA )       2.0gPVP10 20 .0 g1 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖/犜2125 —2008用PBS缓 冲 液 (pH7.2~7.4)溶解 并定 容 至 1 000 mL。3.3.4  洗 涤 缓 冲 液 1 000 犿犔吐 温20              0.5mLPBS缓 冲 液500 mL500 mL0.2 g无 菌 水叠 氮 化 钠 (NaN3)3.3.5  抗 体 稀 释 缓 冲 液1× PBS缓 冲 液0.5%牛 血 清 白 蛋 白 (BSA )3.3.6  底 物 缓 冲 液 (狆犎9.8)1000 犿犔二 乙 醇 胺            97mL加 蒸 馏 水800 mL0.2 g叠 氮 化 钠 (NaN3)用 盐 酸 (HCl)调pH至 9.8,然后 定 容 至 1 000 mL3.3.7  底 物 溶 液在 底 物 缓 冲 液 中 加 入 碱 性 磷 酸酶 的 底 物 对 硝 基 苯 磷 酸 钠 (狆NitrophenylPhosphate,pNPP ),浓 度为 1 mg/mL 。检 测 试 剂。3.4 犘犆犚3.4.1 犚犖犃抽 提 缓 冲 液20 m mol/L TrisHCl,pH8.01 m mol/L EDTA ,pH 8.01% SDS,0.2%β巯 基 乙 醇3.4.2 犜犈   缓 冲 液10 m mol/L TrisHCl,pH8.01 m mol/L EDTA ,pH 8.03.4.3 犜犃犈  缓 冲 液40 m mol/L TrisHAc1 m mol/L EDTA ,pH 8.03.4.4 6×加 样 缓 冲 液溴 酚 蓝        0.25%3.4.5  引 物 合 成根 据 已 报 道 的以