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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖／犜２１２５ —２００８李 痘 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳 犘犾狌犿 狆狅狓 狏犻狉狌狊２００８０９０４ 发 布２００９０３１６ 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１２５ —２００８前 言 本 标 准 的 附 录为 资 料 性 附 录。Ａ本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 标 准 起 草 单 位 ：中 华 人 民 共 和 国 广 东 出入 境 检 验 检 疫 局 、中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究 院 动 植 物 检 疫 研究 所 、中 华 人 民 共 和 国 辽 宁 出 入 境 检 验 检疫 局。本 标 准 主 要 起 草 人 ：陈 定 虎 、王 章 根 、李明 福 、胡 学 难 、李 桂 芬 、王 秀 芬 、冯 黎 霞 、管 维。本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１２５ —２００８李 痘 病 毒 检 疫 鉴 定 方 法１ 范 围本 标 准 规 定 了 李 痘 病 毒 检 疫 和 鉴 定 的 基 本 原则 和 方 法。本 标 准 适 用 于 带 有 李 痘 病 毒 的 所 有 进 出 境 的无 性 繁 殖 材 料 、组 培 苗 、种 子 和 果 实 的 检 疫 鉴 定。２ 原 理李 痘 病 毒 学 名 ：Ｐｌｕｍｐｏｘ ｖｉｒｕｓ（ＰＰＶ），别 名 ：Ｓｈａｒｋａ ｖｉｒｕｓ，是核 果 类 果 树 危 险 性 最 大的 病 毒 之 一，其 外 壳 蛋 白 的 特 异 性 和 核 酸 序 列 的 特 殊 性 是本 标 准 制 定 的 主 要 依 据 ；该 病 毒 的分 类 地 位 、地 理 分 布 、寄主 范 围 和 症 状 、传 播 途 径 、血 清 学 特 性及 基 因 组 特 征 等 参 见 附 录 Ａ。３ 仪 器 设 备 、用 具 及 试 剂３．１ 仪 器 设 备３．１．１ 酶 标 检 测 仪。扩 增 仪。３．１．２ ＰＣＲ３．１．３ 电 泳 仪。３．１．４ 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机。３．１．５ 凝 胶 成 像 系 统。３．１．６ 电 子 分 析 天 平。３．２ 用 具３．２．１ 移 液 器 （０．１ μＬ ～２μＬ ，２ μＬ ～１０ μＬ ，１０ μＬ ～１００ μＬ ，１００μＬ ～１ ０００ μＬ）。３．２．２ 研 钵。３．２．３ ０．２ｍＬ 、０．５ｍＬ 、１．５ ｍＬ３．２．４ 酶 联 板。离 心 管。检 测 试 剂３．３ 犈犔犐犛犃３．３．１ 包 被 缓 冲 液 １ ０００ 犿犔 （狆犎９．６）碳 酸 钠 （Ｎａ２ＣＯ ３） １．５９ｇ碳 酸 氢 钠 （ＮａＨＣＯ３）叠 氮 化 钠 （ＮａＮ３）２．９３ ｇ０．２ ｇ溶 于 １ ０００ ｍＬ蒸 馏 水 中 ，溶 液 的 ｐＨ为 ９．６，不需 要 调 ｐＨ值。３．３．２ 犘犅犛缓 冲 液 １ ０００ 犿犔 （狆犎７．２～７．４）氯 化 钠 （ＮａＣｌ） ８ｇ磷 酸 二 氢 钾 （Ｋ Ｈ ２ＰＯ４）磷 酸 氢 二 钠 （Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ ２Ｏ）氯 化 钾 （ＫＣｌ）０．２ ｇ２．９ ｇ０．２ ｇ０．２ ｇ叠 氮 化 钠 （ＮａＮ３）用 无 菌 水 溶 解 并 定 容 至 １ ０００ ｍＬ。３．３．３ 样 品 抽 提 缓 冲 液 １ ０００ 犿犔二 乙 基 碳 酰 二 胺 （ＤＩＥ ＣＡ ） ２．０ｇＰＶＰ１０ ２０ ．０ ｇ１ 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜２１２５ —２００８用ＰＢＳ缓 冲 液 （ｐＨ７．２～７．４）溶解 并定 容 至 １ ０００ ｍＬ。３．３．４ 洗 涤 缓 冲 液 １ ０００ 犿犔吐 温２０ ０．５ｍＬＰＢＳ缓 冲 液５００ ｍＬ５００ ｍＬ０．２ ｇ无 菌 水叠 氮 化 钠 （ＮａＮ３）３．３．５ 抗 体 稀 释 缓 冲 液１× ＰＢＳ缓 冲 液０．５％牛 血 清 白 蛋 白 （ＢＳＡ ）３．３．６ 底 物 缓 冲 液 （狆犎９．８）１０００ 犿犔二 乙 醇 胺 ９７ｍＬ加 蒸 馏 水８００ ｍＬ０．２ ｇ叠 氮 化 钠 （ＮａＮ３）用 盐 酸 （ＨＣｌ）调ｐＨ至 ９．８，然后 定 容 至 １ ０００ ｍＬ３．３．７ 底 物 溶 液在 底 物 缓 冲 液 中 加 入 碱 性 磷 酸酶 的 底 物 对 硝 基 苯 磷 酸 钠 （狆ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌＰｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＮＰＰ ），浓 度为 １ ｍｇ／ｍＬ 。检 测 试 剂。３．４ 犘犆犚３．４．１ 犚犖犃抽 提 缓 冲 液２０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０１ ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ ，ｐＨ ８．０１％ ＳＤＳ，０．２％β巯 基 乙 醇３．４．２ 犜犈 缓 冲 液１０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０１ ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ ，ｐＨ ８．０３．４．３ 犜犃犈 缓 冲 液４０ ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＨＡｃ１ ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ ，ｐＨ ８．０３．４．４ ６×加 样 缓 冲 液溴 酚 蓝 ０．２５％３．４．５ 引 物 合 成根 据 已 报 道 的以
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