中华人民共和国国家标准 GB4789.11-2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验 2014-12-01发布 2015-05-01实施  GB4789.11—2014 前言 本标准代替 GB/T 4789.11－2003《食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验》。 本标准与 GB/T 4789.11－2003 相比，主要变化如下： ——修改了标准名称； ——修改了范围； ——增加了术语和定义； ——修改了设备与材料； ——修改了培养基与试剂； ——删除了以无菌生理盐水稀释样品的步骤和杆菌肽敏感试验； ——增加了触酶试验； ——增加了附录 A。 I  GB4789.11—2014 食品安全国家标准 食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验 1 范围 本标准规定了食品中 β型溶血性链球菌（Streptococcus）的检验方法。 本标准适用于食品中 β型溶血性链球菌的检验。 2 术语和定义 2.1 β型溶血 在菌落周围形成完全透明的溶血环，红细胞完全溶解。 2.2 β型溶血性链球菌 能够产生 β型溶血的化脓（或A群）链球菌（Streptococcuspyogenes）和无乳（或 B群）链球菌 （Streptococcus agalactiae）。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a) b) c) d) e) f) 恒温培养箱：36℃±1℃； 冰箱：2℃～5℃； 厌氧培养装置； 天平：感量 0.1 g； 均质器与配套均质袋； 显微镜：10倍～100倍； g) h) i) 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头； 无菌锥形瓶：容量 100 mL、200 mL、2 000 mL； 无菌培养皿：直径 90 mm； j) pH计或pH比色管或精密pH试纸； 水浴装置：36℃±1℃； k) l) 微生物生化鉴定系统。 4 培养基和试剂 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 改良胰蛋白胨大豆肉汤（Modified tryptone soybean broth, mTSB）：见附录 A中A.1。 哥伦比亚 CNA血琼脂(ColumbiaCNA blood agar)：见附录 A中A.2。 哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar)：见附录 A中A.3。 革兰氏染色液：见附录 A中A.4。 胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone soybean broth, TSB）：见附录 A中A.5。 草酸钾血浆：见附录 A中A.6。 1  GB4789.11—2014 4.7 4.8 4.9 0.25％氯化钙(CaCl2)溶液：见附录 A中A.7。 3％过氧化氢(H2O2)溶液：见附录 A中A.8。 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。 5 检验程序 溶血性链球菌检验程序见图 1。 样品 25g（或 mL）+ 225 mL mTSB 36℃±1℃ 18 h ~ 24 h 划线接种哥伦比亚 CNA血琼脂平板 36℃±1℃ 18 h～24 h，厌氧培养 挑取可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB 36℃±1℃ 18 h～24 h 革兰氏染色镜检/触酶试验 确定鉴定 链激酶试验(选做项目) 生化鉴定 报告 图1溶血性链球菌检验程序 6 操作步骤 6.1 样品处理及增菌 按无菌操作称取检样 25 g（mL），加入盛有 225 mL mTSB的均质袋中，用拍击式均质器均质1 min～ 2 min；或加入盛有 225 mL mTSB的均质杯中，以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min。若样品为 液态，振荡均匀即可。36℃±1℃培养 18 h～24 h。 6.2 分离 将增菌液划线接种于哥伦比亚 CNA血琼脂平板，36℃±1℃厌氧培养18 h～24 h，观察菌落形态。 溶血性链球菌在哥伦比亚 CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2 mm～3 mm，灰白色、半透 2  GB4789.11—2014 明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐，并产生 β型溶血。 6.3 鉴定 6.3.1 分纯培养 挑取 5个（如小于5个则全选）可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB增菌液，36℃±1℃ 培养 18 h～24 h。 6.3.2 革兰氏染色镜检 挑取可疑菌落染色镜检。β型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性，球形或卵圆形，常排列成短链状。 6.3.3 触酶试验 挑取可疑菌落于洁净的载玻片上，滴加适量 3%过氧化氢溶液，立即产生气泡者为阳性。β型溶血性 链球菌触酶为阴性。 6.3.4 链激酶试验（选做项目） 吸取草酸钾血浆 0.2 mL于0.8 mL灭菌生理盐水中混匀，再加入经36℃±1℃培养 18 h～24 h的可 疑菌的 TSB培养液0.5 mL及0.25%氯化钙溶液 0.25 mL，振荡摇匀，置于 36℃±1℃水浴中 10 min，血 浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动）。继续 36℃±1℃培养 24 h，凝固块重新完全 溶解为阳性，不溶解为阴性，β型溶血性链球菌为阳性。 6.3.5 其他检验 使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。 7 结果与报告 综合以上试验结果，报告每 25 g（mL）检样中检出或未检出溶血性链球菌。 3