12391—1990中华人民共和国国家标准食物中核黄素的测定方法Method for determination of riboflavin in foodsGB/T 12391—19901主题内容与适用范围本标准规定了用微生物法和荧光法测定食物中核黄素含量。本标准适用于各类食物中核黄的测定。第一篇微生物法2原理某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，简称 L.C. ）的生长需要核黄素；培养基中若缺乏这种维生素该细菌；便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况。以及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品中核黄素的含量。3试剂本实验用水均需蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。3．1冰乙酸。3．2甲苯。3．3无水乙酸钠。3．4乙酸铅。3．5氢氧化铵。3．6干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei ATCC 7489）。3．7盐酸：0.1 mol/L。3．8氢氧化钠：1 mol/L和0.1mol/L。3．90.9%氯化钠溶液（生理盐水）：使用前应进行灭菌处理。3．10核黄素标准储备液（25ug/mL）：将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过24 h后。准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4 mL冰乙酸和1.5 L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2 L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。3．11 核黄素标准中间液（10 ug/mL）,准确吸取20mL核黄素标准储备液，加水稀释至50 mL。3．12核黄素标准中间液（0.1 ug/mL），准确吸取1.0 mL中间液于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次分析要配制新标准使用液。3．13碱处理蛋白胨：分别称取40 g蛋白胨和20g氢氧化钠于250mL水中。混合后，放于37±0.5℃恒温箱内，24～48 h后取出，用冰乙酸调节pH至6.8，加14g无水乙酸钠（或23.28 含有 3分子结晶水的乙酸钠），稀释至800mL，加少许甲苯盛于溶液表面，于冰箱中保存。3．140.1%胱氨酸溶液：称取1 gL—胱氨酸于小烧杯中。加20mL水，缓慢加入经约 5～10 mL 盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至 1 L，加少许甲苯盖于溶中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施 12391—1990液表面。3．15酵母补充液：称取 100 g 酵母提取物干粉于 500 mL 水中、称取 150 g乙酸铅于500mL水中。将两溶液混合，以氢氧化铵调节pH至酚酞量红色（取少许溶液检验）。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节pH至5.5。通入硫化氢直至不生沉淀。过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。3．16甲盐溶液：称取25 g磷酸氢二钾和25 g磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释至500 mL。加放少许甲苯以保存之。3．17乙盐溶液：称取10g硫酸镁（MgSO4·7H2），0.5g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和0.5 g硫酸锰（MnSO4·4H2O），加水溶解，并稀释至500mL，加少许甲苯以保存之。3．18基本培养储备液：将下列试剂混合于 500 mL 烧杯中，加水至 450 mL，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8，用水稀释至500mL。碱处理蛋白胨0.1%胱氨酸溶液酵母补充液甲盐溶液100 mL100 mL20 mL10 mL10 mL10 g乙盐溶液无水葡萄糖3．19琼脂培养基：将下列试剂混合于 250 mL 三角瓶中，加水至 100 mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，用 1 mol/L 盐酸趁热调节 pH 至 6.8。尽快倒入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，于高压锅内在5.9×10Pa（10lb/in）压力下灭4 2菌15 min，取出后直立试管，冷至室温，于冰箱中保存。无水葡萄糖乙酸钠（NaAc·3H2O）蛋白胨1 g1.7 g0.8 g0.2 g0.2 mL0.2 mL1.2 g酵母提取物干粉甲盐溶液乙盐溶液琼脂3．200.04%溴甲酚绿指示剂：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研钵磨。用水稀释至 250 mL。3．210.04%溴麝香草酚蓝指示剂：称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于小研钵中，加1.6 mL和0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250 mL。4仪器与设备4．1实验室常用设备。4．2电热恒温培养箱。4．3离心沉淀机。4．4液体快速混合器。4．5离压消毒锅。5菌种的制备与保存中华人民共和国卫生部1990—03—19批准1990—12—01实施 12391—19905．1储备菌种的制备：以 L·C·纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在37±0.5℃恒温培养箱中保温16～24 h。贮于冰箱内，至多不超过2周，最好每周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使用前每天移种一次，连续 2～3 d方可使用，否则生长不好。5．2种子培养液的制备：取5mL核黄素标准使用液和5mL基本培养储备液于15mL离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×10Pa（10lb/in）压力下灭4 2菌15 min。每次可制备2～4管。6操作步骤因核黄素易被日光和紫外线破坏，故一切操作要在暗室内进行。6．1接种液的制备：使用前一天，将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中，同时制作二管。在37±0.5℃保温16～24h。取出后离心10min（3000rpm），以无菌操作方法倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗二次，再加10mL消毒生理盐水，在液体快速混合器上振摇试管，使菌种成混悬体。将此液倾入已消毒的注射器内，立即使用。6．2样品的制备6．2．1将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。