中华人民共和国国家标准 GB4789.7—2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 2013-11-29发布 2014-06-01实施  GB4789.7—2013 前言 本标准代替GB/T 4789.7-2008《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》。 本标准与GB/T 4789.7-2008相比，主要变化如下： ——修改了标准的中文名称； ——修改了范围； ——修改了设备和材料； ——修改了培养基和试剂； ——修改了样品制备过程； ——修改了检验程序。 I  GB4789.7—2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 1 2 范围 本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。 本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： a)恒温培养箱：36℃±1℃； b)冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃； c)恒温水浴箱：36℃±1℃； d)均质器或无菌乳钵； e)天平：感量 0.1 g； f)无菌试管：18mm×180 mm、15 mm×100 mm； g)无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头； h)无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL、1000 mL； i)无菌培养皿：直径90 mm； j)全自动微生物生化鉴定系统； k)无菌手术剪、镊子。 3 培养基和试剂 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录 A中A.1。 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录 A中A.2。 3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录 A中A.3。 3％氯化钠三糖铁琼脂：见附录 A中A.4。 嗜盐性试验培养基：见附录 A中A.5。 3％氯化钠甘露醇试验培养基：见附录 A中A.6。 3％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录 A中A.7。 3％氯化钠 MR-VP培养基：见附录A中A.8。 3％氯化钠溶液：见附录 A中A.9。 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 我妻氏血琼脂：见附录 A中A.10。 氧化酶试剂：见附录 A中A.11。 革兰氏染色液：见附录 A中A.12。 ONPG试剂：见附录A中A.13。 Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录 A中A.14。 弧菌显色培养基。 1  GB4789.7—2013 3.16 生化鉴定试剂盒。 4 检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图1。 样品 25 g（mL）+225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水 定性 定量 接种 3%氯化钠碱性蛋白胨水 3管，3个适宜的连续稀释度 36℃±1℃，8 h～18 h 36℃±1℃，8 h～18 h TCBS或弧菌显色培养基 36℃±1℃，18 h～24 h 挑取可疑菌落，接种于 3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂 36℃±1℃，18 h～24 h 筛选试验 氧化酶试验，革兰氏染色， 3％氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验 生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生 物生化鉴定系统 血清学试验、神奈川试验 （选做项目） 结果与报告 图1 副溶血性弧菌检验程序 5 操作步骤 5.1 样品制备 5.1.1 非冷冻样品采集后应立即置 7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在 45℃以下不 超过 15 min或在2℃～5℃不超过 18 h解冻。 5.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动 物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表 面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。 2  GB4789.7—2013 5.1.3 以无菌操作取样品 25 g（mL），加入 3%氯化钠碱性蛋白胨水 225 mL，用旋转刀片式均质器以 8 000 r/min均质1 min，或拍击式均质器拍击 2 min，制备成 1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放 入无菌乳钵，自 225 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入 500 mL 无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品 1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部 放入锥形瓶，充分振荡，制备 1:10的样品匀液。 5.2 增菌 5.2.1 定性检测 将 5.1.3制备的1:10样品匀液于36℃±1℃培养 8 h～18 h。 5.2.2 定量检测 5.2.2.1 用无菌吸管吸取 1:10样品匀液1 mL，注入含有 9 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇 试管混匀，制备 1:100的样品匀液。 5.2.2.2 另取 1 mL无菌吸管，按5.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一 次，换用一支 1 mL无菌吸管。 5.2.2.3 根据对检样污染情况的估计，选择 3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种 1 mL。置 36℃±1℃恒温箱内，培养 8 h～18 h。 5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下 1 cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或 弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于 36℃±1℃培养 18 h～24 h。 典型的副溶血性弧菌在 TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似 5.3.2 口香糖的质感，直径 2 mm～3 mm。从培养箱取出 TCBS平板后，应尽快（不超过1 h）挑取菌落或标记 要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。 5.4 纯培养 挑取 3个或以上可疑菌落，划线接种3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养 18 h～24 h。 5.5 初步鉴定 5.5.1 5.5.2 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，副溶血性弧菌为氧化酶阳性。 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。副溶血性弧菌为革兰氏阴性，呈 棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 5.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种 3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养 24 h