ICS 65.020.30 B 43 DB12 天津市地方标准 DB12/T 956—2020 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大 肠埃希氏菌的测定 酶底物法 Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia Coli in dairy farm manure – Enzyme substrate method 2020 - 08 - 18发布 2020 - 10 - 01实施 天津市市场监督管理委员会 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医 学研究所。 本标准主要起草人：赵润、李辰宇、王景峰、张克强、谌志强、杜连柱、梁雨。 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底 物法 1 范围 本标准规定了基于酶底物法测定规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的技 术要求及操作方法。 本标准适用于规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的同时测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27522—2011 畜禽养殖污水采样技术规范 HJ 1001—2018 水质 总大肠菌群，粪大肠菌群和大肠埃希氏菌测定 酶底物法 3 术语和定义 HJ 1001—2018界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了方便使用，以下重复列出了HJ 1001—2018中的某些术语和定义。 3.1 总大肠菌群和粪大肠菌群 total coliforms and fecal coliforms 奶牛场粪污中常见的肠杆菌科细菌，恒温（总大肠菌群：37 ℃；粪大肠菌群：44.5 ℃）培养后可 分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色邻硝基苯酚。 3.2 大肠埃希氏菌 Escherichia Coli 俗称大肠杆菌，恒温37 ℃培养后既能够分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG） 生成邻硝基苯酚，同时可以分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365 nm 紫外光源照射下显蓝色。 [HJ 1001—2018，定义3.3] 3.3 最大可能数 most probable number（MPN） 一种基于泊松分布的间接计数方法。根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性 数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在数量。 [HJ 1001—2018，定义3.4] 4 粪污样品采集 4.1 采样物品 采样容器应使用一次性无菌容器，或经121 ℃、20 min高压灭菌处理。其余采样工具、文具、器具、 防护用品按照GB/T 27522—2011中第4.1款规定执行。 4.2 采样方法 按照GB/T 27522—2011中第4.4.2款的规定执行。 4.3 样品保存 采样后应在低温（4 ℃）条件下保存并在6 h内完成测定。 5 酶底物测定 5.1 方法原理 在选择性培养基中培养18 h～24 h，总大肠菌群和粪大肠菌群能够产生β-半乳糖苷酶并分解培养 底物中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成邻硝基苯酚（ONP），该物质在白光或日光照射下显 黄色。大肠埃希氏菌可以分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365 nm 紫外光源照射下显蓝色。计数97孔板中阳性单元格出现数量，查MPN表，分别计算样品中总大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的浓度值。 5.2 试剂材料 5.2.1 分析时应使用符合GB/T 6682—2008中三级水规定要求的实验用水，并经121 ℃、20 min高压 灭菌后使用。 5.2.2 培养基宜采用H