附件2肉制品中刚果红的测定BJS 201807 1范围本方法规定了肉制品中刚果红的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于肉制品中刚果红的测定。原理试样经氨水乙醇溶液提取，用正己烷去除提取液中的脂肪后用液相色谱串联质谱法进行测定，外标法定量。试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。1.1试剂3.1.1乙腈（C2H3N）：色谱纯。3.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.3乙醇（C2H5OH）：色谱纯。3.1.4正己烷（C6H14）：优级纯。3.1.5甲酸铵（CH5NO2）：色谱纯。3.1.6氨水（NH3·H2O）：含量 25%～28%。1.2试剂的配制3.2.1氨水乙醇溶液（20+80）：移取氨水（3.1.6）20 mL，加入 80ml乙醇（3.1.3），混匀备用。3.2.2 5mmol/L甲酸铵溶液：称取甲酸铵（3.1.5）0.315 g，加适量的水溶解，定容至1000mL，混匀。1.3标准品刚果红标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1，纯度≥98 %表 1刚果红标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称刚果红英文名称CAS登录号分子式相对分子量Congo Red573-58-0C32H22N6Na2O6S2696.661.4标准溶液的配制称取10 mg（精确到0.1 mg）刚果红标准品于100 mL量瓶中，加入少量甲醇溶解后，用甲醇定容，得到100 μg/mL的标准储备溶液，4℃避光保存6个月。仪器和设备1.51.61.71.81.91.10液相色谱四极杆串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源涡旋振荡器组织捣碎机高速离心机，10000 r/min电子天平，感量 0.0001g和 0.01g旋转蒸发仪分析步骤1.11试样制备取适量有代表性的试样切成小块，组织捣碎机捣碎，均质分成两份，作为试样和留样，分别装入洁净容器中，密封并标记，于﹣18℃避光保存。1.12样品前处理准确称取2 g（精确至0.01g）试样于50 mL离心管中，加入10 mL氨水乙醇溶液（3.2.1），在涡旋振荡器上提取 2 min后置于离心机中以5000r/min离心5 min，把上层提取液溶液全部转移至另一离心管中，用10 mL氨水乙醇溶液重复提取一次，合并提取液。在提取液中加入30 mL正己烷于涡旋振荡器上混合 2 min后，5000 r/min离心2 min，弃去正己烷，将下层溶液全部转移至旋蒸瓶中，60℃下旋蒸至干，用5mL甲醇溶解残渣。取部分溶解液至离心管中，10000 r/min离心10 min后，取上清液上机测试。1.13仪器条件1.13.1液相色谱条件a）色谱柱：C18色谱柱（3.0mm×100mm，3.5μm），或性能相当者；b）流动相：流动相A为5 mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度洗脱程序见表2；2表 2梯度洗脱程序时间/min流动相 A（%）流动相 B（%）08020802080205.06.08.08020c）流速：0.3 mL/min；d）柱温：35℃；e）进样量：1μL。2.1.1质谱条件a）电离方式：电喷雾负离子模式；b）检测方式：多反应监测（MRM）；c）雾化气压力：40 psi；d）干燥气温度：320℃；e）干燥气流速：9.0 L/min；f）毛细管电压：4.0kV；g）监测离子对、碎裂电压和碰撞能量见表3。3表 3刚果红的监测离子对、碎裂电压和碰撞能量中文名称刚果红监测离子对(m/z）325.0/152.0碎裂电压( V）碰撞能量(eV）1301303913325.0/416.0 *注：*为定量离子对3.1定性确证进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准溶液一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度（k）与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表4中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测组分。4表4定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%k>50%50%≥k>20%20%≥k>10%k≤10%允许的相对偏差/%±20±25±30±504.1定量测定4.1.1标准曲线的制备将刚果红标准溶液（3.4）用甲醇逐级稀释成0.25μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μ