大豆疫霉病菌检疫鉴定方法MethodsforthequarantineandidentificationofPhytophthorasojaeKaufmann&GerdemannSN／T1131—2002前言本标准的附录B是规范性附录，附录A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：彭金火、张大凯、金林。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围本标准规定了进出境植物检疫中大豆疫霉病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于大豆夹带土壤中大豆疫霉病菌的检疫和鉴定，同时也适用于大豆疫病已发生地区大豆疫霉病菌的土壤分离和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所用的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T18085—2000植物检疫小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法3原理3H侵染任何生育阶段的大豆寄主，包括根、茎、叶、豆荚和种子，但以引起大豆根腐病和茎腐病较为普遍，英文名：aot.i1大豆疫霉病菌的分类地位大豆疫霉病菌d(Phy)属鞭毛菌亚门top(MhtahorstaigsoojmyaeKiaufmnaa)，卵菌纲nn&G(Oerdeomanetn，异名esP.meg)，霜霉目(Paspereronmaf.osposp.gralelyscine)，腐霉科aKu(Pan&Eytrwihiacn和P.megasperma)，疫霉属(Pvahytophr.sphtthorojaehora)，可ldebrancotmyceaeSoy—beanPhytoastemndrorot，简称大豆疫霉病。3.2检疫原理该病原真菌是典型的土壤习居菌，主要以抗逆性很强的卵孢子在土壤中和土壤中的寄主残体内越冬并长期生存。当田间温度和湿度适宜时，卵孢子打破休眠萌发，产生孢子囊。雨后或灌溉后有积水时，孢子囊很快释放出大量游动孢子，游动孢子被雨水冲溅到寄主表面，或受寄主分泌物的吸引，朝根系游动并最终侵染寄主。有水时，在寄主根部外表形成大量孢子囊，在内部形成大量卵孢子。本标准根据病原菌的这一特性，先收集土壤并在适宜条件下培养一定时间，使卵孢子萌发产生孢子囊，然后加水浸泡，使孢子囊释放出游动孢子，再加感病大豆品种的叶碟诱集游动孢子，待游动孢子侵染叶碟并在叶碟边缘(偶尔在叶碟表面)产生新的孢子囊并释放出游动孢子时，即可进行病原菌的分离和鉴定。3.3鉴定原理大豆疫霉病菌的生物学特性、形态学特征等与其他疫霉种不同，是鉴定该病原菌的依据。4仪器设备444444......1生物显微镜(具油镜镜头)2目镜和镜台测微尺3具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于50倍)4干热灭菌器5高压灭菌器6普通天平(感量1／100) 4444444444444444................7分析天平(感量1／100000)8超净工作台9生物培养箱(具40m0lx以上的光照)11111111112220酒精灯1铁臼2医用注射器(10L)及针头(18号)3医用手术剪、镊子4烧杯5试管(直径6培养皿(直径(5mL、50mmL、l000mL)12m)9cm)7载玻片(28盖玻片(19三角瓶(2585.3mmm×76.2mm，厚0.8mm)m×18mm)0mL)0量筒(500mL)1滴管2Parafilm膜或无色透明塑料袋5药品555555......1抗菌素及杀菌剂1111....1苯莱特(benomyl，研究用纯粉剂或市售可湿性粉剂n，研究用纯粉剂或市售医用内服片剂n，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂)2制霉菌素(nystati)3青霉素(p(cehnilocriloalmip)4氯霉素henicol，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂)2席尔氏浮载剂B／3琼脂粉见GT18085—2000附录A。555...4无荧光显微镜物镜镜头油(Nd=1.516)5永久封片剂6培养基及用途6.1基础培养基用于病原菌的保存和培养性状的观察、测定。建议采用绿豆培养基(GGA)，利马豆培养基(LBA)或V8培养基(V8A)，其配制方法及步骤见附录A.1。6.2半选择性培养基用于大豆疫霉病菌游动孢子的萌发、菌株的纯化和病原菌的分离及再分离。1霉素100m0mL基础培养基经常规灭菌并冷却到55℃左右时加入下列抗菌素，摇匀，倒平板：制霉菌素4mg、苯来特2mg(均为有效成分)。其中研究用纯苯莱特粉剂和纯氯霉素粉剂需事先配制成酒精溶液(母液)，并使培养基中的最终酒精浓度不大于0.5％。g、青霉素250mg～500mg、氯0 制霉菌素和苯来特可用多菌灵代替(10mg)；氯霉素可用利福平(10mg)代替；青霉素可用安苄青霉素(250mg～500mg)代替。6.3液体培养基用于病原菌的液体培养以及产生孢子囊。建议采用豌豆液体培养基，其配制方法及步骤见附录A.2。7检疫方法和程序77..1土壤样品的收集11.1现场取样仔细从大豆中挑拣土壤。2加工过程中取样7..大豆制油加工流程中通常需去除杂质，杂质可粗分为三类，即石块、土块