17721772ICS65.020.30 B22 D B 32 备案号： 江 苏省地方标准 DB32/T1772—2011 副猪嗜血杆菌病诊断技术 DiagnosticTechniquesforHaemophilusparasuis 2011-05-06发布 2011-07-06实施 发布 江苏省质量技术监督局  DB32/T1772—2011 前 言 为规范副猪嗜血杆菌病的诊断技术，特制定本标准。 本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编制。 本标准由江苏省农业科学院提出。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准起草人：刘茂军、邵国青、周勇岐、王海燕、冯志新、孙佩元、甘源。 I  DB32/T1772—2011 副猪嗜血杆菌病诊断技术 1范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌病诊断技术要求。 本标准规定的分离鉴定和PCR法适用于本病的确诊，间接血凝试验适用于大批量样品的普查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。 GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541动物疫病实验室检验采样方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 副猪嗜血杆菌病 副猪嗜血杆菌病，又称格拉泽氏病或革拉泽氏病(Glasser’s disease)，该病由副猪嗜血杆菌 （Haemophilusparasuis,HPs）引起，可以影响各年龄段猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常 见于5～8周龄的猪，表现为猪的纤维性多发性浆膜炎、关节炎、胸膜炎和脑膜炎等。 4诊断 据流行病学、临床症状和特征病变可作出初步诊断，典型病变PCR检测病原可确诊。 4.1流行性病学诊断 副猪嗜血杆菌只感染猪，感染2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见 于5周龄～8周龄的猪，发病率一般在10%～15%，严重时死亡率可达到50%。在敏感猪群内，副猪 嗜血杆菌引起的死亡主要发生在幼猪。 4.2临床诊断 由副猪嗜血杆菌引起的急性型疾病是非特异性的但却是特征性的，临床症状包括发热、食欲不振和 厌食，严重时可见呼吸困难、发绀、不愿活动、关节肿胀、跛行、运动不协调以及死亡。 急性发病耐过猪可以痊愈,但病症严重，猪耐过后往往表现慢性病症，主要是被毛粗乱、咳嗽、呼 吸困难和生长迟滞。有些猪由于发生脑膜炎而表现肌肉震颤、麻痹和惊厥，有些因腹膜粘连而常引起肠 梗阻。 1  DB32/T1772—2011 4.3病理变化 肉眼可见的损伤主要是在单个或多个浆膜面，可见浆液性和化脓性纤维蛋白渗出物，这些浆膜包括 腹膜，心包膜和胸膜，这些损伤也可能涉及脑膜和关节表面，尤其是腕关节和跗关节。胸腹腔积液或粘 连，关节肿胀、关节腔粘液增多，肺脏出血、表面有纤维素性渗出物附着，全身淋巴结水肿、出血。在 显微镜下观察渗出物，可见纤维蛋白，中性粒细胞和较少量的巨噬细胞。病死猪及病料应符合按GB16548 的规定。 5病原学诊断 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682—2008的灭菌二级水。 5.1病原分离与鉴定 5.1.1材料准备 巧克力琼脂平板，鲜血琼脂平板，TSA固体培养基，TSB液体培养基，副猪嗜血杆菌标准菌株，细菌 微量生化鉴定管，灭菌棉拭子等。 5.1.2病料采集 按NY/T541规定的方法，采集呼吸道分泌物，采取具有特征的肺脏、肝脏、脾脏、胸膜、胸腹腔积 水、心包积液、心血、关节液和脑组织。 5.1.3病原分离 采集样品，首先在巧克力琼脂平板、TSA固体培养基、鲜血琼脂平板上分别划线接种，37℃培养48 h～72h以后挑取单个菌落，再进行纯培养并鉴定。 细菌涂片，革兰氏染色镜检。如果为革兰氏阴性小杆状或多形性小杆菌，再进行一次巧克力琼脂亚 克隆培养，同时接种鲜血琼脂平板和普通琼脂平板。 巧克力琼脂平板生长良好，而鲜血琼脂平板和普通琼脂平板没有菌落生成则菌株保存待进一步鉴 定。 5.1.4病原鉴定 5.1.4.1生长特性试验 挑取被检分离株和副猪嗜血杆菌标准株菌落接种绵羊鲜血琼脂平板和2%胨琼脂平板上，再以金黄色 葡萄球菌点种或垂直划线，置37℃培养48h。 观察葡萄球菌菌落周围菌落生成情况，如愈靠近金黄色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈远 的愈小，甚至不见菌落生长，且不出现溶血现象判为阳性。 5.1.4.2生化实验 培养物接种于添加有NAD的脲酶、氧化酶、吲哚，接触酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、核糖、 半乳糖、硝酸盐还原酶等细菌微量生化鉴定管，置37℃培养48h。按细菌微量生化鉴定管说明书判定。 脲酶试验、氧化酶试验、吲哚试验均阴性，并接触酶、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳 糖、硝酸盐还原试验均阳性者判为副猪嗜血杆菌阳性。 5.1.4.3聚合酶链式反应（PCR） 2  DB32/T1772—2011 按5.2进行操作和判定。 5.1.5结果判定 以上实验皆为阳性判为副猪嗜血杆菌。 5.2聚合酶链式反应（PCR） 5.2.1材料准备 PCR引物P15`-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3`和P25`-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3`， PCR相关试剂。副猪嗜血杆菌标准菌株DNA提取物为阳性对照，水作为阴性对照。 高速离心机（10000r/min）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽凝胶成像系统（或紫外投射仪）、移 液器等仪器。 5.2.2DNA模板的制备 按NY/T541规定的方法，采集待检猪的病料置于-20℃保存。取约1g病料，剪碎后匀浆器加5mL 水研磨成糊状，煮沸10min，高速10000r/min离心5min，取上清-20℃保存备用。另外，按GB16548 规定处理待检猪。 取可疑培养物10000r/min离心5min，弃上清，沉淀以无菌水重悬，煮沸10min，高速10000r/min 离心5min，取上清-20℃保存备用。 分离纯化的菌株用接种环刮取2个菌落洗脱于含100μL无菌水的离心管，煮沸10min，高速10000 r/min离心5min，取上清-20℃保存备用。 5.2.3PCR PCR反应体系：10×PCRBuffer2.5μL，Mg2+（25mM）1.3μL，P1（20pmol/μL）1.0μL， P2（20pmol/μL）1.0μL，dNTPs（2.5mM）2.0μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板 2μL～5μL，加ddH2O至总体积25μL。反应条件：94