ICS11. 220 DB21 B41 辽 宁省地方标准 DB21/ T2468—2015 新城疫免疫抗体监测技术规范 Technical specification formonitoring immune antibody of Newcastle disease 2015 -04 -30发布 2015 -06 -30实施 辽宁省质量技术监督局 发布  DB21/ T2468—2015 前 言 本标准按照GB/ T1. 1- 2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：王宏燕、赵晓彤、薛树山、闫海滨、马建山、石霖、李清竹、吴运谱、何欣、 王志国、赵鹏、李晓楠。 I  DB21/ T2468—2015 新城疫免疫抗体监测技术规范 1 范围 本标准规定了新城疫免疫抗体监测技术中的样品采集和制备、血凝试验、血凝抑制试验的操作规程 和综合判定。 本标准适用于新城疫疫苗免疫抗体监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 HA：血凝（hemaggl ut i nat i on） HAU：血凝单位（hemaggl ut i nat i onuni t） HI：血凝抑制（hemaggl ut i nat i oni nhi bi t i on） 4 器材与试剂 4. 1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、 96孔90度V形血凝反应板。 4. 2 阿氏液( Al sever' sSol ut i on)：配制方法参见附录A中 A. 1。 4. 3pH7. 20. 01mol / L磷酸盐缓冲液（PBS）：配制方法参见附录 A中 A. 2。 4. 41%鸡红细胞悬液：配制方法参见附录 A中 A. 3。 4. 5 标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。 5 抽样样本量大小的确定 5. 1 无限群抽样样本量n值的计算 按照预期新城疫免疫抗体合格率为70%,可接受的最大绝对误差为5%，置信水平为95%，根据公式 n=p( 1- p)×z / e计算出n值，其中z值为95%置信水平对应的标准正态分布1-α/ 2百分位点，为1. 96，将 22 p=0. 7、z=1. 96、e=0. 05计算出n值为323。 5. 2 有限群抽样样本量nα值的计算 根据公式nα=n×N/ ( N+n)，计算出群体实际抽样数量，其中N为群体数量，nα为抽样数量。 1  DB21/ T2468—2015 6 样品采集和制备 6. 1 血液采集 将鸡侧卧保定后，用酒精棉球消毒翅静脉窝区，在距离翅静脉窝约0.3 cm处，使针管与近心端保持 45度进针，稍稍将针头轻插进血管，轻拉活塞，当有血液开始被吸出后，保持注射器位置不动，让血液 缓缓吸入注射器针管内，达到所需的采血量后，用棉球压迫血管上的伤口约30 s。 6. 2 血清分离 采集到血液后，立即将针头拔掉，把注射器内的血液沿着试管壁徐徐注入，不能有气泡，也不能振 荡。逐一编号，仔细核对，倾斜放置。血液样品夏天在常温下、冬天在25 ℃～37 ℃温箱中放置1h左右， 析出血清。 6. 3 血清运输 运输时将血清与采样记录一同装入隔热坚固、内装适当冷冻剂和防震材料的专用运输容器中。外包 装上要加贴生物安全警示标志。 6. 4 血清保存 血清保存在-20 ℃～-70 ℃低温冰箱中，避免反复冻融。 7HA试验方法 7. 1 取新城疫病毒抗原1瓶，加入2mLPBS，充分溶解，制成新城疫病毒抗原悬液。 7. 2 取孔面规整、内壁光滑的96孔90度V型血凝反应板，在 A1～C12孔中加入0. 025mLPBS。 7. 3 吸取0. 025mL新城疫病毒抗原悬液，加入 A1～C1孔，吹打3～5次充分混匀。 7. 4 从A1～C1孔吸取0. 025 mL加入第 A2～C2孔，混匀后吸取0. 025 mL加入A3～C3孔，依次进行倍 比稀释至 A11～C11孔，最后从A11～C11孔吸取0. 025mL弃去。 7. 5A1～C12孔补加0. 025mLPBS。 7. 6A1～C12孔加入1%鸡红细胞悬液，A12～C12孔为红细胞对照。 7. 7 振荡混匀后，在20 ℃～25 ℃的条件下静置 40mi n后观察结果。 7. 8 当红细胞对照孔A12～C12孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时，判定结果。以完全凝集红细 胞的病毒抗原悬液的最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度。完全凝集红细胞的病毒抗原悬液的最大稀释倍 数为 1个血凝单位（HAU）。 8HI试验方法 8. 14HAU抗原配制 按照GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术的要求配制4个血凝单位（4HAU）的新城疫病毒抗原。 8. 24HAU抗原回滴 8. 2. 1 取血凝反应板，在A1～C5孔加入0. 025mLPBS。 8. 2. 2 吸取0. 025mL4HAU新城疫病毒抗原，加入 A1～C1孔，混匀后倍比稀释至A4～C4孔，混匀后 吸取 0. 025mL弃去。 2  DB21/ T2468—2015 8. 2. 3A1～C5孔中补加0. 025mLPBS。 8. 2. 4A1～C5孔加入1%鸡红细胞悬液，A5～C5孔为红细胞对照。 8. 2. 5 振荡混匀后，在20 ℃～25 ℃条件下静置 40mi n后观察结果。 8. 2. 6 当红细胞对照孔A5～C5孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时，判定结果。A1～C2孔完全 凝集，则 4HAU抗原配制准确；仅 A1～C1孔完全凝集或A1～C2孔均有红细胞流淌，需补加病毒抗原； A1～C3孔或A1～C4孔完全凝集，需补加PBS。若 4HAU抗原回滴出现上述后两种情况，则需要重新回滴， 直