ICS 65.020.01 B 04 DB12 天津市 地方标准 DB12/T 506—2014 大豆转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified soybean 2014-04-22发布 2014-07-20实施 天津市质量技术监督局发布  DB12/T 506—2014 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由天津市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人：黄凤军、陈杰、朱珠、李建、马强、赵新、龙起成、陈慧。 本标准 2014年04月首次发布。 I  DB12/T 506—2014 大豆转基因成分筛查方法 1范围 本标准规定了大豆中转基因成分定性 PCR筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。 本标准适用于大豆及其制品中 Lectin内标准基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4-epsps基 因、Bt基因和bar/pat基因的定性PCR筛查检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672转基因植物及其产品检测通用要求 农业部 2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽样 农业部 1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Lectin基因 Lectingene 编码大豆凝集素的基因。 3.2 CaMV 35S启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus（CaMV） 来自花椰菜花叶病毒的 35S启动子。 3.3 NOS终止子 terminator of nopaline synthase（NOS）gene 来自胭脂碱合成酶基因 NOS的终止子。 3.4 CP4-epsps基因 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene derived fromAgrobacterium sp. CP-4。 来源于土壤农杆菌株系 （Agrobacteriumsp.）CP4株系一段可编码5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸 合酶的基因。 3.5 Bt基因 Bt（Bacillus thuringiensis）gene 来源与苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt），可表达一种杀虫晶体蛋白的基因，常 见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。 3.6 bar/pat基因 bialaphos resistance gene/phosphinothricin acetyltransferase gene 1  DB12/T 506—2014 bar 基因来源于土壤吸水链霉菌（ Streptomyceshygroscopicus），pat基因来源于绿产色链霉菌 （Streptomyces viridochromogens），均编码膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinthricin acetyltransferase，PAT）， 该酶具有对除草剂草丁膦（glufosinate）的耐受性。bar基因和pat基因具有较高的同源性。 4检测方法 4.1试剂和材料 4.1.1实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682规定的一级水。 4.1.2琼脂糖。 4.1.310g/L溴化乙锭溶液：称取1.0 g溴化乙锭（EB），溶于100 mL水中，避光保存。 注：溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.410mol/L氢氧化钠溶液：在160 mL水中加入80.0 g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容 到 200 mL。 4.1.5500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）：称取 18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2）， 加入 70 mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液（4.1.4），加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠 溶液（4.1.4）调 pH至8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 4.1.61 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH 8.0）：称取121.1 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶 解于 800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌20 min。 4.1.7 TE缓冲液（pH 8.0）：分别量取10 mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（4.1.6）和2 mL乙二 铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 4.1.850×TAE缓冲液：称取242.2 g三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用300 mL水加热搅拌溶解后， 加 100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液（4.1.5），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使用 时用水稀释成 1×TAE。 4.1.9加样缓冲液：称取 250.0 mg溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解12 h；称取 250.0 mg二甲基 苯腈蓝，用 10 mL水溶解；称取50.0 g蔗糖，用30 mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4℃下保存。 4.1.10 4.1.11 DNA分子量标准：可以清楚的区分50 bp～1 000 bp的DNA片段。 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸 溶液等体积混合。 4.1.12 4.1.13 Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。 引物：大豆内标准基因和转基因大豆外源基因检测时所用的引物序列见表 1。 表1大豆内标准基因和转基因大豆