ICS 67.050B 31DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T 648—2016黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法Methods of identifying varietal purity of cucumber by using SSR-based markers2016-09-27发布2016-11-01实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T 648—2016前言本标准按照 GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心。本标准主要起草人：兰青阔、张桂华、王惠哲、赵新、王成、崔兴华、朱珠、陈锐、徐石勇。本标准 2016年9月首次发布。IDB12/T 648—2016黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法12范围本标准规定了黄瓜品种纯度SSR分子标记检测方法的术语和定义、检测方法、纯度计算方法。本标准适用于黄瓜单交种的纯度检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T 2474黄瓜品种鉴定技术规程SSR分子标记法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1品种纯度Varieties Purity品种纯度指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。3.2聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain Reaction）一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。3.3简单重复序列SSR（Simple Sequence Repeat）由几个核苷酸（1-6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个 bp（一般为100-200bp）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.4分子标记Molecular Marker以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，检测生物在遗传上的差异。4原理1DB12/T 648—2016SSR分布于黄瓜整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用 PCR技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行黄瓜品种纯度检测。5仪器设备及试剂5.1仪器设备PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000 V，400mA，400 W）；万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；TaqDNA聚合酶（含Mg2+的10×PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；Gold View染料；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.3溶液配制相关溶液配制方法见附录A。6方法步骤6.1取样按照GB/T 3543.2规定方法扦样，从送检样品中随机取10 g种子，分别随机取其亲本种子10粒。单粒种子的 DNA提取6.26.2.1样品预处理在玻璃培养皿底部垫上一层厚度适宜的棉花，用自来水浸湿后均匀地撒上种子，再于表面覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16小时28℃光照培养，8小时22℃暗培养，待种子长出子叶后备用。也可采用经验证的、等效的培养条件。6.2.2DNA提取取单株幼苗子叶，放入1.5 mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5 mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管放入400 μL混合样品，将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30min后取下，向离心管中加入400 μL 24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10 000 g离心10 m