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中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖／犜２４２８ —２０１０犬 瘟热 诊 断方 法犇犻犪犵狀狅狊狋犻犮狋犲犮犺狀犻狇狌犲狊犳狅狉犮犪狀犻狀犲犱犻狊狋犲犿狆犲狉２０１００１１０ 发 布２０１００７１６ 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 犛犖／犜２４２８ —２０１０前 言 本 标 准 的 附 录 Ｃ 为规 范 性 附 录 ，附 录 Ａ 、附 录 Ｂ 为 资 料 性 附 录。本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 标 准 起 草 单 位 ：中 华 人 民 共 和 国黑 龙 江 出 入 境 检 验 检 疫局 、中 华 人 民 共 和 国 山东 出 入 境 检 验 检疫 局。本 标 准 主 要 起 草 人 ：张 子 群 、谢 晓 峰 、岳志 芹 、何 浩 、徐 义 刚 、李 维 刚 、由 轩 、金 宁。本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 犛犖／犜２４２８ —２０１０犬 瘟 热 诊 断 方 法１ 范 围本 标 准 规 定 了 犬 瘟 热 （Ｃａｎｉｎｅ Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ，ＣＤ ）的 检 疫 技 术 规 范 ，包 括 犬 瘟 热 病 毒 （ＣＤＶ）的 分 离 与 鉴定 、间 接 免 疫 荧 光 技 术 、免 疫 酶 试 验 、免疫 酶 组 织 化 学 试 验。本 标 准 适 用 于 犬 瘟 热 的 检 疫。２ 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 条 款 通 过 本 标 准 的 引 用 而 成 为本 标 准 的 条 款 。 凡 是 注 日 期 的 引 用文 件 ，其 随 后 所 有的 修 改 单 （不 包 括 勘 误 的 内 容 ）或 修 订版 均 不 适 用 于 本 标 准 ，然 而 ，鼓 励 根 据 本 标 准 达 成 协 议 的 各 方 研 究是 否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期的 引 用 文 件 ，其 最 新 版 本 适 用 于 本 标 准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法３ 概 述犬 瘟 热 （ＣＤ ）相 关 资 料 参 见 附 录Ａ。ＣＤ 的诊 断 可 以 通 过 流 行 病 学 、临 床 症 状 、病 理 剖 检 变 化 对 犬 瘟 热 作 出 初步 诊 断 ，对 ＣＤ进 行 病 毒 分 离 鉴 定 、间 接 免 疫 荧 光 技 术 、免疫 酶 试 验 、免 疫 酶 组 织 化 学 试 验 等 实 验 室 诊 断。作 出 确 诊 可４ 临 床 诊 断根 据 临 床 症 状 和 病 理 学 检 查 ，参 见 附 录Ｂ ，可 做 初 步 诊 断 依 据。５ 实 验 室 诊 断 技 术５．１ 病 毒 分 离 与 鉴 定５．１．１ 材 料 准 备５．１．１．１ 实 验 材 料 和 试 剂５．１．１．１．１ Ｖｅｒｏ 细 胞 （非 洲 绿 猴 肾 细 胞 ）、Ｍ ＤＣＫ细 胞 （犬 肾 传 代细 胞）。５．１．１．１．２ 溶 液 配 制 ：包 括 细 胞 培 养 液 、细 胞 维 持 液 、细胞 分 散 液 、ＰＢＳ 等 。 配 方 及 配 置方 法 见 附 录 Ｃ。实 验 用 水 应 符 合 ＧＢ／Ｔ６６８２ 要 求。５．１．１．２ 设 备 和 器 材５．１．１．２．１ 细 胞 培 养 瓶 、细 胞 培 养 板。５．１．１．２．２ 吸 管。５．１．１．２．３ 二 氧 化 碳 培 养 箱。５．１．１．２．４ ３７ ℃ 恒 温 水 浴 箱。５．１．１．２．５ 普 通 冰 箱 和 低 温 冰 箱。５．１．１．２．６ 离 心 机 及 离 心 管。５．１．１．２．７ 研 磨 器 械。５．１．１．２．８ 普 通 光 学 显 微 镜 和 倒 置 显 微 镜。５．１．１．２．９ 微 量 加 样 器 ，容 量 ５ μＬ ～５０ μＬ ，５０ μＬ ～２００μＬ。１ 犛犖／犜２４２８ —２０１０５．１．１．２．１０ ０．４５μｍ微 孔 滤 器。５．１．１．３ 组 织 悬 液 的 制 备ＣＤＶ存 在 于 病 犬 心 脏 、肺 脏 、脾脏 、胸 腺 、淋 巴 结 等 组 织 器 官 中 。 无 菌 采 集 这 些 器 官 用 加双 抗 （含 青霉 素 ２ ０００ ＩＵ／ｍＬ、链 霉 素 ２ ０００ μｇ／ｍＬ ）的细 胞 维 持 液 ，制 成 ２０ ％ 组 织 悬 液 ，４ ℃ 浸 泡 ４ ｈ，然 后 反 复 冻融 ３ 次 ，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离 心 ３０ｍｉｎ ，取 上 清 液 ，－ ２０℃ 冷 冻 保 存 ，备用 。 试 验 前 ，１００００ ｒ／ｍｉｎ 离心２０ ｍｉｎ ，取 上 清 液 ，用 于 ＣＤＶ５．１．２ 操 作 方 法分 离。５．１．２．１ 细 胞 分 离 法用 常 规 方 法 培 养 细 胞 单 层 ，待 长 至 ８０ ％ 左 右 时 ，用于 ＣＤＶ分 离 。 吸 去培 养 液 ，用 无 血 清 培 养 液 洗涤 １ 次 。 如 用 细 胞 培 养 瓶 ，按 １ｍＬ／２５ ｃｍ 接 种 处 理 好 的 组织 上 清 液 ，每 样 接 种两 瓶 ；如 用 细 胞 培 养２板 ，则 按 每 孔 ０．１ｍＬ 接 种 处 理好 的 组 织 上 清 液 ，每 样 接 种 ２ 孔 。３３℃ 吸 附 １ ｈ，弃去 上 清 液 ，加 入 细 胞维 持 液 ，置 ３７ ℃５％ 二 氧 化 碳 培 养 箱 内 培养 ，２４ ｈ 后 逐 日 观 察 细 胞 病 变 ，连 续 观 察 ５ ｄ～７ｄ。５．１．２．２ 结 果 观 察ＣＤＶ感 染 Ｖｅｒｏ细 胞 ３ ｄ～４ｄ 后 、Ｍ ＤＣＫ 细 胞２ ｄ 后 ，
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