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版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准犛犖／犜２１５５ —２００８建 兰 花 叶 病 毒 检 测 方 法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀 狅犳 犆狔犿犫犻犱犻狌犿犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊２００８０９０４ 发 布２００９０３１６ 实 施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜 ２１５５ —２００８前 言本 标 准 的 附 录 Ｂ 、附 录 Ｃ 为 规 范 性 附 录，附 录 Ａ 为 资 料 性 附 录。本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。本 标 准 起 草 单 位 ：中 国 检 验 检 疫 科 学 研 究院 、中 华 人 民 共 和 国 上 海 出 入 境 检 验 检 疫 局。本 标 准 主 要 起 草 人 ：相 宁 、张 永 江 、杨翠 云 、于 翠。本 标 准 系 首 次 发 布 的 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标准。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜 ２１５５ —２００８建 兰 花 叶 病 毒 检 测 方 法１ 范 围本 标 准 规 定 了 建 兰 花 叶 病 毒 检 测 鉴 定 的 基 本原 则 和 方 法。本 标 准 适 用 于 可 能 带 有 建 兰 花 叶 病 毒 的 所 有进 境 兰 花 种 苗 ，包 括 商 品 种 苗 、组 培 苗 和 脱 毒 苗 等 兰 花种 质 的 检 疫 和 鉴 定。２ 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 条 款 通 过 本 标 准 的 引 用 而 成 为本 标 准 的 条 款 。 凡 是 注 日 期 的 引 用文 件 ，其 随 后 所 有的 修 改 单 （不 包 括 勘 误 的 内 容 ）或 修 订版 均 不 适 用 于 本 标 准 ，然 而 ，鼓 励 根 据 本 标 准 达 成 协 议 的 各 方 研 究是 否 可 使 用 这 些 文 件 的 最 新 版 本 。 凡 是 不 注 日 期的 引 用 文 件 ，其 最 新 版 本 适 用 于 本 标 准。ＳＮ／Ｔ１８４０ 植 物 病 毒 免 疫 电 镜 检 测 方 法３ 原 理建 兰 花 叶 病 毒 学 名 ：Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ，缩写 ：Ｃｙｍ Ｍ Ｖ 。 建 兰 花 叶 病 毒 是 侵 染 兰 花 的 主 要病毒 之 一 ，其 血 清 学 特 性 、外 壳 蛋 白 的 特异 性 是 本 标 准 制 定 的 主 要 依 据 ，该 病 毒的 分 类 地 位 、地 理 分 布 、寄主 范 围 和 症 状 、传 播 方 式 、粒 体 形 态 及基 因 组 特 征 等 参 见 附 录 Ａ。４ 仪 器 、用 具 及 试 剂４．１ 仪 器４．１．１ 透 射 式 电 子 显 微 镜。４．１．２ 酶 联 检 测 仪。４．１．３ 电 子 天 平。４．１．４ ＰＣＲ仪。４．１．５ 凝 胶 成 像 系 统。４．１．６ 榨 汁 机。４．１．７ 高 速 冷 冻 离 心 机。４．１．８ 超 速 离 心 机。４．２ 用 具４．２．１ 可 调 移 液 器 （０ ．１ μＬ ～ ２ μＬ ，２ μＬ ～ １０ μＬ ，１０ μＬ ～ １００ μＬ ，１００ μＬ ～ １ ０００ μＬ ）和 可 调 移 液器 头。４．２．２ 酶 联 板。４．２．３ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管。４．２．４ 研 钵。４．３ 犈犔犐犛犃检 测 试 剂４．３．１ 包 被 缓 冲 液 （狆犎 ９．６）碳 酸 钠 １．５９ ｇ碳 酸 氢 钠叠 氮 化 钠２．９３ｇ０．２０ｇ溶 于 ９００ ｍＬ蒸 馏 水 中 ，用 盐 酸 调 至 ｐＨ９．６，再 用 蒸馏 水 补 足 １ Ｌ。１ 版权所有·禁止翻制、电子传阅、发售犛犖／犜 ２１５５ —２００８４．３．２ 犘犅犛磷 酸 盐 缓 冲 液 （狆犎 ７．４）氯 化 钠８ｇ磷 酸 二 氢 钾磷 酸 氢 二 钠氯 化 钾０．２ｇ１．１５ｇ０．２ｇ０．２０ｇ叠 氮 化 钠溶 于 ９００ ｍＬ蒸 馏 水 中 ，用 氢 氧 化 钠 调 至 ｐＨ７．４，再用 蒸 馏 水 补 足 １ Ｌ。４．３．３ 洗 涤 缓 冲 液 （犘犅犛犜）吐 温２００５ ｍＬＰＢＳ加 至 １ Ｌ４．３．４ 样 品 抽 提 缓 冲 液亚 硫 酸 钠１．３ｇ２０ｇ聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 （ＰＶＰ）ＰＢＳＴ加 至 １ Ｌ４．３．５ 酶 标 抗 体 稀 释 缓 冲 液ＰＢＳＴＰＶＰ１ Ｌ２０ ｇ２．０ｇ牛 血 清 白 蛋 白４．３．６ 底 物 缓 冲 液二 乙 醇 胺９７ ｍＬ６００ ｍＬ０．２ｇ水叠 氮 化 钠用 盐 酸 调 至 ｐＨ９．８，加 水 至 １ Ｌ。５ 病 毒 检 测 （采 用 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 实 验 犈犔犐犛犃）５．１ 实 验 步 骤５．１．１ 按 要 求 的 浓 度 或 １ μｇ／ｍＬ用 包 被 缓 冲 液 稀 释 包 被 抗体 ，每 孔 加 １００ μＬ 。 将 酶 联 板 加 盖 或 用保鲜 膜 包 好 ，放 在 ３７ ℃孵 育 ２ ｈ。５．１．２ 清 空 酶 联 板 中 溶 液 ，用加 满 各 孔 ，３ ｍｉｎ 后 倒 掉 ，孔 向 下 在滤 纸 上 拍 干 ，再 重 复 二 次。ＰＢＳＴ５．１．３ 取 １ ｇ 待 检 测 组 织 研 碎 ，加 入 １０ ｍＬ的 抽 提 缓 冲 液 ，２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 后 取 上 清 液 得到待 检 样 品 。 分 别 将 稀 释 到 适 当 浓 度 的 阳 性 对 照 、阴
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