进出口贝类中记忆丧失性贝类毒素检验方法MethodforthedeterminationofamnesicshellfishpoisoninshellfishforimportandexportSN/T1070—2002前言本标准是按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》及SN/T0001—1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求而进行编写的。其中测定方法是参考有关文献中所载的贝类中记忆丧失性贝类毒素分析方法，经研究、改进和验证后，按规定格式编写的。在标准中同时制定了抽样方法和制样方法。本标准测定低限是根据国际上对贝类中记忆丧失性贝类毒素的最高限量和本测定方法的灵敏度而制定的。本标准的附录A为提示的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：唐守亭、卫锋、宋文斌、陈明生。本标准首次发布。1范围本标准规定了海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品的记忆丧失性贝类毒素检验的抽样、制样和液相色谱测定方法。本标准适用于进出口海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品(不包括盐渍制品)的记忆丧失性贝类毒素的检验。2抽样和制样2.1检验批以不超过2抽样数量10000箱为一检验批，同一检验批以商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.表1不同批量抽样数量批量/箱0及以下1～1～最低抽样数/箱153815320032010000132.3抽样方法按2.2规定的抽样箱数随机抽取，逐件开启。每箱至少取500g作为原始样品，原始样品总量不得少于2kg。装入盛样器内，加封后，标明标记，及时送实验室。2.4分析样品的采集分析样品要有充分的代表性，取样个数不少于12个贝类个体，即从2kg混合样品中挑选良好的贝去壳，去壳肉量应达200g。对于个体过小的品种，则以去壳后肉量不少于200g来决定采集个数。22..5试样制备5.1生鲜贝类先用清水将贝壳外表彻底洗净，然后切断闭壳肌、开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取0出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不得加热或用麻醉剂。将收集的20质。g贝肉置于10号筛子中沥水5min(不要使肉堆积)，检出碎壳等杂物，将贝肉均22..55.2冷冻贝类在室温下，使冷冻的样品(带壳或脱壳的)呈半冷冻状态，按2.5.1方法开壳、淋洗、取肉、均质。.3贝类罐头 将罐内所有内容物(肉及液体)倒入均质器充分均质。如果是大罐，将贝肉沥汤并收集沥下的汤汁，分别称量，将固形物和汤汁按比例混合、充分均质。2.5.4贝肉干制品干制品可于水中浸泡(冷藏)，按2.5.3方法沥干、均质。2.6试样保存5中处理的样品于注：抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生软骨藻酸含量变化。3测定方法将上述2.-18℃以下冷冻保存。3.1方法提要样品以甲醇2试剂和材料/水提取，经LC-SAX强阴离子柱固相萃取(SPE)净化，用反相液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。333333333.........22222222........1水：Milli-Q系统净化。2甲醇：色谱纯。3乙腈：色谱纯。4三氟乙酸：优级纯。5一水柠檬酸：优级纯。6柠檬酸三铵：优级纯。7乙腈/水(1∶9，Ｖ／Ｖ)。80.5mol/L柠檬酸溶液(pH=3.2)：40.4g一水柠檬酸和14.0g柠檬酸三铵溶解于400mL水中，以浓氨水调pH为3.2，加入50mL乙腈，完全溶解后，以水定容至500mL。333...222...911LC-SAX柱：3mL(Supelco,USA)，或相当者。0μｇ／ｍＬ0软骨藻酸标准储备液：DACS-1C(10,NationalResearchCouncilCanada)，或相当者。1、0.5、1.0、2.5、10.0、25.0μｇ／ｍＬ1软骨藻酸标准溶液：以乙腈/水(1∶9，Ｖ／Ｖ)稀释标准储备液(3.2.10)分别配成为含软骨藻酸0.的标准工作溶液。3.3仪器和设备abcdefg)高效液相色谱仪：配有二极管阵列或紫外检测器。)组织均质器：最大转速20000r/min。)台式高速离心机：最大转速6000r/min。)涡旋混匀器。)超声波清洗器。)离心管：5205mmL。L，)容量瓶：50mL。h)微量进样器：133..4测定步骤4.1提取 称取试样m5离心2中，以水定容至刻度，混匀。.0g(精确到0.1in，使固液两相彻底分离。移出上清液至g)于50mL加盖离心管中，加入25mL容量瓶中，残渣再加入10mL甲醇/水(1∶1，Ｖ/Ｖ)溶液，涡旋混匀1min，超声提取5min，以4000r/minL甲醇/水(1∶1，Ｖ/Ｖ)重复提取两遍，上清液均移入05m25mL容量瓶3.4.2净化取上述粗提取液m5.L乙腈/水(1∶9，Ｖ/Ｖ)，0mL移入依次经6AX柱上，待液体以1滴/s的速度流出后，再依次mL柠檬酸洗脱液以1滴/s的速度过柱，弃去流出液，最后用2mL柠檬酸洗脱液洗脱吸附在柱上的软骨藻酸，供色mL甲醇，3mL水，3mL甲醇/水(1∶1，Ｖ/Ｖ)处理过的LC-S用5谱测定。0.5注：在液体过柱时，当液体凹液面下端与柱填料上端水平时，停止液体流出，避免LC-SAX柱填料与空气接触。33..44..3测定3