ICS 65．120B 46中华人民共和国农业行业标准NY/T 1757—2009 饲料中苯骈二氮杂革类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of benzodiazepines in feeds High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2009-04-23发布 2009-05-20 实施中 华 人 民 共 和 国 农 业 部发布Ⅰ NY/T1757—2009前言本标准的附录 A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心(济南)。本标准主要起草人：任爱丽、杨段玲、汤文利、赵金毅、梁萌、李斌、刘学江。Ⅰ NY/T1757—2009饲料中苯骈二氮杂革类药物的测定液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了测定饲料中氯氮革、硝西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、劳拉西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑和地西泮等9种苯骈二氮杂革类药物含量的液相色谱串联质谱法(LC-MS／MS)。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。LC -MS／MS法定量限为0.03 mg／kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T 14699．1饲料采样GB／T 20195动物饲料试样的制备3原理在碱性条件下，用乙酸乙酯提取饲料中苯骈二氮杂革类药物，蒸干提取液用正己烷溶解残渣，经过硅酸镁固相萃取小柱富集、净化，LC-MS／MS分离测定。4试剂和材料除非另有规定，仅使用确认为分析纯的试剂。4．1水，GB／T 6682，一级和三级。4．2甲醇：色谱纯。4．3乙腈：色谱纯。4．4甲酸：优级纯。4．5正己烷。4．6氯化钠。4．7乙酸乙酯。4．8碳酸钠饱和溶液：称取 56 g碳酸钠，加入100 mL水(三级，4．1)，搅拌、配制成饱和溶液。4．90.05％甲酸溶液：准确移取 5.00 mL甲酸(4．4)于100 mL容量瓶中,用水(一级)定容,用0.20 μm膜过滤后，再准确移取 10.00 mL于1 000 mL容量瓶中，用水(一级)定容、摇匀。用前超声5 min。4．10洗脱液 I：甲醇(4．2)＋正己烷(4．5)＋丙酮＝45＋45＋10。4．11洗脱液Ⅱ：甲醇＋水(一级)＝70＋30。4．12苯骈二氮杂革类药物混合贮备溶液(100μg／mL)：分别准确称取 9种苯骈二氮杂革类药物(氯氮革、硝西泮、奥沙西泮、氯硝西泮、劳拉西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑和地西泮)化学对照品(各种药物的纯度以 100％计)10.0 mg(精确到 0.1 mg)于 100 mL容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成浓度各为1 NY/T1757—2009100 μg／mL的苯骈二氮杂革类药物混合贮备溶液。置于4℃～8℃冰箱中保存，有效期为 1个月。4．13苯骈二氮杂革类药物中间溶液 (1.00μg／mL)：准确移取苯骈二氮杂革类药物混合贮备溶液(4．12)1.00 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容。置于4℃ ～8℃冰箱中保存，有效期为 1周。4．14苯骈二氮杂革类药物工作溶液：分别准确移取苯骈二氮杂革类药物中间溶液(4．13)50μL、100μL、200 μL、300 μL、500 μL、750 μL,用洗脱液Ⅱ(4．11)稀释至 1 mL配制成工作溶液,浓度分别为 0.05μg／mL、0.10 μg／mL、0.20 μg／mL、0.30 μg／mL、0.50 μg／mL、0.75 μg／mL。现用现配。4．15硅酸镁固相萃取小柱：500 mg／6 mL。5仪器5．1实验室用样品粉碎机。5．2分析天平：感量 0.1 mg。5．3带盖塑料离心管：100 mL。5．4漩涡混合器。5．5离心机。5．6旋转蒸发仪：配备 150 mL鸡心瓶。5．7氮吹仪。5．8固相萃取装置。5．9超声波清洗器。5．10液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源。6采样6．1采样步骤：按 GB／T 14699．1的规定执行。6．2试样的制备：按 GB／T 20195的规定制备试样,全部通过0.45 mm孔径的筛,混匀，装入密闭容器中避光保存备用。7分析步骤7．1提取称取约 5 g试样(精确到0.1 mg)于离心管(5．3)中，加入 2 g氯化钠(4．6)，加入20 mL三级水，用碳酸钠饱和溶液(4．8)调 pH至9～10。加人 30 mI。乙酸乙酯(4．7)，加盖密封，漩涡(5．4)混匀 1 min，置离心机(5．6)4 360 g离心5 min，吸取上消液于 150 mL鸡心瓶(5．6)中。再加入30 mL乙酸乙酯，重复上述操作，合并 2次提取液。7．2净化将提取液在 60℃的旋转蒸发仪上蒸至近干，用 5 mL正己烷溶解残渣，加载到已用5 mL正乙烷活化的硅酸镁固相萃取小柱(4．15),液体的过柱速度不要超过 1 mL／min；用 3 mL正己烷清洗鸡心瓶，清洗液也加载到硅酸镁固相萃取小柱中；用5 mL洗脱液Ⅰ(4．10)洗脱，收集洗脱液于 10 mL具塞试管中，在 40℃水浴中用氮气(5．7)吹干；再准确移取 3.00 mL洗脱液Ⅱ洗脱，加压吹干硅酸镁固相萃取小柱，收集洗脱液于同一具塞试管中,溶解残渣,漩涡混匀，过 0.20 μm有机滤膜，上机测定。如果上机溶液中各药物的浓度不在工作溶液范围内，用洗脱液Ⅱ进行调整。7．3测定7．3．1液相色谱测定参数的设定色谱柱：C18柱，柱长100 mm，内径 3.0 mm，粒度 1.8 μm或性能类似的分析柱。2 NY/T1757—2009柱温：50℃。进