ICS中华人民共和国国家标准GB/T 19681—2005食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法The method for the determination of Sudan dyes in foods – High performance liquid chromatography 2005-03-29发布2005-03-29实施国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会发布 GB/T 19681—2005前言本标准遵循GB/ T1. 1- 2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》和GB/T20001. 4- 2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的编写规则。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由国家粮食质量监督检验中心归口。本标准起草单位：国家粮食质量监督检验中心，大连市产品质量监督检验所。本标准主要起草人：潘炜、王春燕、李鹏、董广彬、于利军。I GB/T 19681—2005食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法1范围本标准适用于食品中苏丹红染料的检测。本标准规定了食品中苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的高效液相色谱测定方法。方法最低检测限：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ均为10ug/ kg。2术语和定义2. 1苏丹红属偶氮系列化工合成染料。3方法要点样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。4试剂与标准品4. 1 乙腈色谱纯4. 2 丙酮色谱纯、分析纯4. 3 甲酸分析纯4. 4 乙醚分析纯4. 5正己烷分析纯4. 6无水硫酸钠分析纯4. 7层析柱管：1cm（内径）×5cm(高)的注射器管。4. 8层析用氧化铝（中性100目～200目）：105℃干燥 2h，于干燥器中冷至室温，每 100g中加入 2mL水降活，混匀后密封，放置 12h后使用。注：不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将 1ug/ mL的苏丹红的混合标准溶液1mL加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液 60mL完全洗脱为准，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅲ，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红Ⅲ的回收率偏低时表明活性偏高。4. 9氧化铝层析柱：在层析柱管底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至 3 cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用 10mL正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。4. 105%丙酮的正己烷液：吸取 50mL丙酮用正己烷定容至1L。4. 11标准物质：苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ；纯度≥95%4. 12标准贮备液：分别称取苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ及苏丹红Ⅳ各 10. 0mg（按实际含量折算），用乙醚溶解后用正己烷定容至 250mL。5仪器与设备5. 1高效液相色谱仪（配有紫外可见光检测器）1 GB/T 19681—20055. 2分析天平：感量0.1mg5. 35. 45. 5旋转蒸发仪均质机离心机5. 60.45μm有机滤膜67样品制备将液体、浆状样品混合均匀，固体样品需磨细。操作方法7. 17. 1. 1样品处理红辣椒粉等粉状样品称取1 g～5g（准确至0. 001g）样品于三角瓶中，加入10mL～30mL正己烷，超声5mi n，过滤，用10mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中（4. 9），为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0. 5cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10mL～30mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60mL（4. 10）洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5mL，经0. 45μm有机滤膜过滤后待测。7. 1. 2红辣椒油、火锅料、奶油等油状样品称取0. 5 g～2g（准确至0. 001g）样品于小烧杯中，加入适量正己烷溶解（约1 mL～10mL），难溶解的样品可于正己烷中加温溶解。按7. 1. 1中“慢慢加入到氧化铝层析柱??过滤后待测”操作。7. 1. 3辣椒酱、番茄沙司等含水量较大的样品称取10 g～20g（准确至0. 01g）样品于离心管中，加10mL～20mL水将其分散成糊状，含增稠剂的样品多加水，加入30mL正己烷：丙酮=3：1，匀浆5mi n, 3000r pm离心10mi n,吸出正己烷层，于下层再加入20mL×2次正己烷匀浆，离心，合并3次正己烷，加入无水硫酸钠5g脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸干并保持5分钟，用5mL正己烷溶解残渣后，按7. 1. 1中“慢慢加入到氧化铝层析柱??过滤后待测”操作。7. 1. 4香肠等肉制品称取粉碎样品10g～20g（准确至0. 01g）于三角瓶中，加入60mL正己烷充分匀浆5mi n，滤出清液，再以20mL×2次正己烷匀浆，过滤。合并3次滤液，加入5g无水硫酸钠脱水，过滤后于旋转蒸发仪上蒸至5mL以下，按7. 1. 1中“慢慢加入到氧化铝层析柱中??过滤后待测”操作。7. 27. 2. 1推荐色谱条件仪器条件??色谱柱：Zorbax SB-C183.5μm 4. 6mm×150mm（或相当型号色谱柱）流动相：??溶剂 A0.1%甲酸的水溶液：乙腈= 85：15溶剂 B0.1%甲酸的乙腈溶液：丙酮=80：20?梯度洗脱：流速:1mL/min柱温：30℃检测波长：苏丹红Ⅰ478nm；苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ520nm；于苏丹红Ⅰ出峰后切换。进样量 10μl。梯度条件见表1。标准曲线7. 2. 2吸取标准储备液0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6mL，用正己烷定容至25mL，此标准系列浓度为0、0. 16、0. 32、0. 64、1. 28、2. 56μg/ mL,绘制标准曲线。7. 3计算2