ICS 65.020.30 B 44 DB12 天 津 市地方 标 准 DB12/T 863—2019 水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌生产技术 规程 Aquatic probiotics---Technical regulation for production of Bacillus amyloliquefaciens 2019-01 - 14 发布 2019-02- 15 实施 天津市市场监督管理委员会 发布 刖 言 本标准依据GB/T 1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求起草。 本标准由天津市农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业生物技术研究中心。 本标准主要起草人：谢凤行、张峰峰、周可、赵琼、赵玉洁、孙海波、高宝山。 水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌生产技术规程 i范围 本标准规定了解淀粉芽胞杆菌生产中所涉及的生产环境和设备、生产技术流程、质量检测和储运。 本标准适用于水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌的生产。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3095环境空气质量标准 GB 3838地表水环境质量标准 GB 20287农用微生物菌剂 GB/T 26428饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 解淀粉芽胞杆菌 bacillus amyloliquefaciens 属于芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，杆状，有鞭毛，革兰氏阳性菌，芽胞椭圆形，中生或近中生。 3.2 原菌种the original strain 由单菌落分离纯化，并在固体斜面上繁殖保存的菌种。 3.3 一级菌种 first class strain 原菌种在培养皿上活化，挑取单菌落接种至三角瓶中，振荡培养的菌种。 3.4 二级菌种 second class strain 三角瓶中的菌种接种至种子罐中，在种子罐中放大培养的菌种。 4生产环境和设备要求 4.1生产环境 4.1.1厂区空气质量符合大气环境质量标准GB 3095中II类要求。 4.1.2发酵用水符合地表水环境质量标准GB 3838中III类水质要求，冷却水及其他用水符合该标准中 IV类水质要求。 4.1.3生产车间配备消毒灭菌设施，菌种储藏室和无菌操作间与生产车间分开。 42生产设备 生产设备需为不锈钢发酵罐，体积根据生产规模自定。 5生产技术流程 5.1生产流程 生产技术流程见附录A 5.2菌种质量 5.2.1用于发酵的菌种应有菌种鉴定报告或菌株来源相关信息。 5.2.2在发酵前应先检测菌种的纯度和性能，如不纯或退化，应先进行提纯复壮。 5.2.3菌种在上罐生产之前需检测种子罐中菌体的纯度和浓度，不能有杂菌污染，浓度达到每毫升亿 级以上。 5.3 培养基 5.3.1原菌种和一级菌种的培养基应保证菌种生长的延滞期短，生长旺盛，碳、氮源营养丰富。 5.3.2二级菌种培养基原则上为发酵培养基或接近发酵培养基。 5.3.3发酵培养基在保证菌体生长旺盛，利于芽胞形成的前提下，尽量利用来源充足、价格低廉的原 料。 5.4 灭菌 5.4.1液体发酵，发酵罐的装液量50%.70%，液体培养基、发酵设备、管道、补料罐等采用高压蒸汽 灭菌，灭菌条件为 121 °C.125 °C，0.1 MPa.0.15 MPa，灭菌 20 min.30 min。 5.4.2 固体物料含水率50%.60%，121 C.130 C，灭菌1.0 h.2.0 h。 5.4.3灭菌后无菌操作取灭菌后的培养基，制片，染色，镜检，无微生物说明灭菌彻底，若有，需重 复5.3的工作。 5.5接种 摇瓶种子到发酵罐种子接种量为1%.5%，种子罐到发酵罐接种量为5%.7%。接种保证无菌操作，调 节进、排气阀，使接种口有气体排出。 5.6发酵 5.6.1芽胞杆菌的发酵温度为25 C.37 C。 5.6.2液体发酵在发酵过程中通入无菌空气，通气量为10 m3/h.t.20 m3/h.t，搅拌转数80 r/min. 150 r/min。 5.6.3芽胞率达到80%以上终止发酵。 5.6.4发酵周期2