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版权所有·禁止翻制、电子发售 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 犛犖／犜２８５３ —２０１１ 闭 合 孢 子 虫 病 检 疫 技 术 规 范 犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲 狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉 犿犻犽狉狅犮狔狋狅狊 犿犪犮犽犻狀犻 ２０１１０５３１ 发 布 ２０１１１２０１ 实 施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布 版权所有·禁止翻制、电子发售 中 华 人 民 共 和 国 出 入境 检 验 检 疫 行 业 标 准 闭 合 孢 子 虫 病 检 疫 技 术 规 范 ＳＮ／Ｔ２８５３ — ２０１１ 中 国 标准出 版社 出版 北 京 复 兴 门 外 三 里 河北 街 １６号 邮 政 编 码 ：１０００４５ 网 址 ｗｗｗ．ｓｐｃ 电 话 ：６８５２３９４６ ６８５１７５４８ 中 国 标 准 出 版 社 秦 皇岛 印 刷 厂 印 刷 开 本８８０ × １２３０ １／１６ 印 张１．７５ 字 数 千 字 ４９ ２０１１ 年 １１月 第 一 版 ２０１１ 年 １１ 月 第 一 次印 刷 印 数 １—１６００ 书 号 ：１５５０６６·２２２６７１ 定 价２７ ．００ 元 版权所有·禁止翻制、电子发售 犛犖／犜２８５３ —２０１１ 前 言 本 标 准 按 照 ＧＢ／Ｔ１．１—２００９ 给 出 的 规 则 起 草 。 本 标 准 是 参 考 采 用ＯＩＥ 的 《水 生 动 物疾 病 诊 断 手 册 》（２００６ 版 ）中２．２．５章 《闭 合 孢 子 虫 感 染 》（ｉｎ ｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｋｒｏｃｙｔｏｓ ｍａｃｋｉｎｉ），对涉 及 组 织 学 、透 射电 镜 及 原 位 杂 交 检 测 的 部 分内 容 进 行 了 补 充 和 完 善。 本 标 准 由 国 家 认 证 认 可 监 督 管 理 委 员 会 提 出并 归 口。 本 标 准 起 草 单 位 ：中 华 人 民 共 和 国 厦 门 出入 境 检 验 检 疫 局 、中 华 人 民 共 和 国 深 圳 出 入 境 检 验 检 疫 局 和 中 华 人 民 共 和 国 山 东 出 入 境 检 验 检 疫 局。 本 标 准 主 要 起 草 人 ：孔 繁 德 、徐 淑 菲 、刘荭 、陈 信 忠 、龚 艳 清 、王 景 明 、周 斌 华 、徐 彪。 Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子发售 犛犖／犜２８５３ —２０１１ 闭 合 孢 子 虫 病 检 疫 技 术 规 范 １ 范 围 本 标 准 规 定 了 用 于 检 测 牡 蛎 闭 合 孢 子 虫 病 的临 床 诊 断 方 法 、组 织 印 迹 法 、组 织 切 片 法 、透 射 电 镜 法、 ＰＣＲ方 法 和 核 酸 原 位 杂 交 等 方 法。 本 标 准 适 用 于 牡 蛎 闭 合 孢 子 虫 病 的 流 行 病 学调 查 、监 测 、诊 断 和 出 入 境 检 验 检 疫。 ２ 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 注 日 期的 版 本 适 用 于 本 文 件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ，其 最 新 版 本 （包括 所 有 的 修 改 单 ）适 用 于 本 文 件。 ＧＢ／Ｔ６６８２ 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 ３ 材 料 和 设 备 ３．１ 试 剂 和 材 料 除 另 有 规定 外 ，下列 所 用 生化 试 剂均 为 分 析纯 。 试 剂 配制 方 法见 附 录Ａ 。 实 验 用水 符 合 ＧＢ／Ｔ６６８２ 要 求。 ３．１．１ 组 织 切 片 制 备 和 染 色 试 剂 ：姬 姆 萨 （Ｇｉｅｍｓａ）染 液 、苏 木 精伊红 染 色 液 、伊 红 染 液 、俾斯 麦 棕 Ｙ、 返 蓝 液 ：ＢＣＩＰ／ＮＢＴ ；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ’ｓ 液 、甲 醛 、戊 二醛 、涂 有 氨 基 烷 基硅 烷 的 载 玻 片 、盖 玻片 、石 蜡 、Ｅｐｓｏｎ ８１２ 、ＤＮＰ３０ 、ＤＤＳＡ（十二 烷 基 琥 珀 酸 酐 ）、Ｍ Ｎ Ａ （六 甲 酸 酐）。 ３．１．２ ＤＮＡ 提 取 试 剂 ：蛋 白 酶 Ｋ 、酚三氯 甲 烷 抽 提 法 所 需 要 的 相 关试 剂 或 其 他 ＤＮ Ａ 抽 提 试 剂 盒。 ３．１．３ ＰＣＲ试剂 ：１０ × ＰＣＲ 缓 冲 液 （不含 镁 离 子 ）、２５ ｍ ｍｏｌ／Ｌ 氯 化 镁 、１０ ｍ ｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、５ Ｕ／μＬ Ｈｏｔｓｔａｒｔ 犜犪狇聚 合 酶 、ＤＮ Ａ ＭａｋｅｒＤＬ２０００、６× 电 泳上 样 缓 冲 液 等 ，均 为 商 品化 试 剂 盒 中 成 分 。 琼 脂 糖 ５×电 泳 缓 冲 液 （ＴＢＥ）。 ３．１．４ 有 机 试 剂 ：甲 醇 、无 水 乙 醇 、丙 酮 、甘 油 、异 丙醇 、二 甲 苯 、氧 化 丙 烯 、封 片 树 胶 和 液 氮。 ３．１．５ 无 机 试 剂 ：氯 化 钠 、磷 酸 氢 二 钠 、磷 酸 二 氢 钠 、叠氮 钠 、醋 酸 铀 、柠 檬 酸 铅 和 海 水。 ３．１．６ 引 物 及 探 针 ：包 括 一 对ＰＣＲ 引 物 和 地 高辛 标 记 的 核 酸 探针 ，均 根 据 ＳＳＵｒＤＮ Ａ 的 基 因 序 列 （ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ４７７ ６２３ ：该 虫 大 小 为 １ ４５７ ｂｐ 片 段 的 序 列 ）设 计。 上 游 引 物 ：５’ＡＧＡＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＧＣＣＴＣＣ３’（１９ｂｐ，位置 ３１８ ～３３６ ） 下 游 引 物 ：５’ＧＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡ ＡＧＧＣ３’（１７ ｂｐ，位置 ８４７ ～８６３ ） 该 对 引 物 扩 增 产 物 大 小 为 ５４６ ｂ
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