文本描述
中华人民共和国国家标准 犌犅１５１９３．５—２０１４ 食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验 ２０１４１２２４发布 ２０１５０５０１实施 中华 人民共和 国 国家卫生和计划生育委员会 发布 犌犅１５１９３．５—２０１４ 前言 本标准代替ＧＢ１５１９３．５—２００３《骨髓细胞微核试验》。 本标准与ＧＢ１５１９３．５—２００３相比，主要变化如下： ———标准名称修改为“食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验”； ———修改了范围； ———增加了术语和定义； ———增加了试验报告； ———增加了试验的解释； ———修改了试验目的和原理 ； ———修改了实验动物； ———修改了给予程序； ———修改了标本制作； ———修改了阅片的内容。 Ⅰ 犌犅１５１９３．５—２０１４ 食品安全国家标准 哺乳动物红细胞微核试验 １ 范围 本标准规定了哺乳动物红细胞微核试验的基本试验方法和技术要求。 本标准适用于评价受试物的遗传毒性作用 。 ２ 术语和定义 ２．１ 微核 细胞有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍留在细胞质中的整条染色单体或 染色体的无着丝断片或环 。在末期单独形成一个或几个规则的次核 ，被包含在细胞的胞质内而形成 。 ２．２ 着丝粒 在细胞分裂期染色体与纺锤体纤维连接的区域 ，以使子染色体有序移动到子细胞两极 。 ２．３ 正染红细胞 成熟的红细胞，其缺乏核糖体并可用选择性核糖体染料与未成熟的嗜多染红细胞区分。 ２．４ 嗜多染红细胞 未成熟的红细胞处于发育的中间期 ，仍含有核糖体，故可用选择性核糖体染料与成熟的正染红细胞 区分。 ２．５ 总红细胞 正染红细胞和嗜多染红细胞的总和 。 ３ 试验目的和原理 哺乳动物红细胞微核试验通过分析动物骨髓和 （或）外周血红细胞，用于检测受试物引起的成熟红 细胞染色体损伤或有丝分裂装置损伤 ，导致形成含有迟滞的染色体断片或整条染色体的微核。这种情 况的出现通常是受到染色体断裂剂作用的结果 。此外也可能在受到纺锤体毒物的作用时，主核未能形 成代之以一组小核，此时小核比一般典型的微核稍大 。 ４ 仪器和试剂 ４．１ 仪器 解剖器械、生物显微镜、载玻片等。 １ 犌犅１５１９３．５—２０１４ ４．２ 试剂 注：全部试剂除注明外均为分析纯 ，试验用水为蒸馏水 。 ４．２．１ 小牛血清：小牛血清滤菌后放入５６℃恒温水浴保温１ｈ进行灭活。通常储存于４℃冰箱里。亦 可用大、小鼠血清代替。 ４．２．２ Ｇｉｅｍｓａ染液：称取Ｇｉｅｍｓａ染料３．８ｇ，加入３７５ｍＬ甲醇研磨，待完全溶解后，再加入１２５ｍＬ甘 油。置３７℃恒温箱保温４８ｈ，期间振摇数次，取出过滤，两周后可用。 ４．２．３ Ｇｉｅｍｓａ应用液：取一份Ｇｉｅｍｓａ染液与６份磷酸盐缓冲液混合而成。现用现配。 ４．２．４ １１５ｍｏｌＬ／／ 磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）： 磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４） ４．５０ｇ ＮａＨＰＯ １２ＨＯ１１．８１ｇ 磷酸氢二钠（ · ） ２ ２ ４ 加蒸馏水至 ４．２．５ 甲醇。 １０００ｍＬ ５ 试验方法 ５．１ 受试物 ５．１．１ 受试物的配制：应将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使 用植物油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或 糊状物等。受试物应现用现配，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。 ５．１．２ 给予途径：应采用灌胃法 。阳性对照物也可采用腹腔注射的方法 。灌胃体积一般不超过 １０ｍＬｋｇ／ 体重，如为水溶液时，最大灌胃体积可达２０ｍＬｋｇ／体重；如为油性液体，灌胃体积应不超过 ４ｍＬｋｇ／ 体重；各组灌胃体积一致。 ５．２ 实验动物 ５．２．１ 动物种、系选择：在利用骨髓时，推荐使用小鼠或大鼠。利用外周血时，推荐用小鼠。如果已经 证实某品系动物脾脏不清除有微核的嗜多染红细胞 ，或对引起染色体结构或数目畸变的化学物检测有 足够的敏感性，则此种动物可以利用 。通常用７周龄～１２周龄，体重２５ｇ～３５ｇ的小鼠或体重２００ｇ～ ３００ｇ的大鼠，在试验开始时，动物体重差异应不超过每种性别平均体重的±２０％。每组用两种性别的 动物至少各５只。 ５．２．２ 动物准备：试验前动物在试验动物房应进行至少 ３ｄ～５ｄ环境适应和检疫观察 。 ５．２．３ 动物饲养：实验动物饲养条件 、饮用水、饲料应符合国家标准和有关规定（ＧＢ１４９２５、ＧＢ５７４９、 ＧＢ１４９２４．１、ＧＢ１４９２４．２、ＧＢ１４９２４．３）。每个受试物组动物按性别分笼饲养 ，每笼 只。试验期间实验 ５ 动物喂饲基础饲料，自由饮水。 ５．３ 剂量 受试物应设三个剂量组 ，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和 （或）个别动物出现死亡的 剂量，一般可取１２ＬＤ／５０，低剂量组应不表现出毒性 ，分别取 ／和／ 作为中、低剂量。急 １４ＬＤ １８ＬＤ ５０ ５０ 性毒性试验给予受试物最大剂量 （最大使用浓度和最大灌胃容量 ）动物无死亡而求不出 ＬＤ５０时，高剂量 组则按以下顺序： ａ） １０ｇｋｇ／ 体重； ｂ）人的可能摄入量的１００倍； ）一次最大灌胃剂量进行设计 ，再下设中、低剂量组。另设溶媒对照组。阳性对照物可用环磷酰 ｃ ２ 犌犅１５１９３．５—２０１４ 胺４０ｍｇｋｇ／ 体重经口或腹腔注射 （首选经口）给予。 ５．４ 试验步骤和观察指标 ５．４．１ 受试物给予 经口灌胃。根据细胞周期和不同物质的作用特点 ，可先做预试，确定取材时间。常用３０ｈ给受试 物法。即两次给受试物间隔２４ｈ，第二次给受试物后６ｈ采集骨髓样品。试验还可以有以下 ２种采样 方式： ａ） 以受试物１次给予动物。以适当的间隔采集骨髓样品至少２次，开始不早于给予后２４ｈ，最后 不晚于给予后４８ｈ。早于给予后２４ｈ的采样，应说明理由。外周血采样以适当的间隔至少 ２次，开始不早于给予后３６ｈ，最后不晚于给予后 ７２ｈ。如在一个采样时间发现阳性结果，则 不需要进一步采样。 ｂ） 每天１次给予，共２次或多次（间隔２４ｈ）给予，可在末次给予后１８ｈ～２４ｈ之间采集骨髓 １次，对外周血可在末次给予后 ３６ｈ～４８ｈ之间采样 次。若选用外周血正染红细胞的含微 １ 核细胞率作为试验观察终点 ，动物给予的时间应达４周以上。 ５．４．２ 标本制作 ５．４．２．１ 骨髓样品：处死后取胸骨或股骨 ，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀 ，常规涂片， 或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成
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