ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2549—2015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程 Method of detecting lactase gene in piglets 2015—12—15发布 2016—02—15实施 辽宁省质量技术监督局发 布  DB21/T 2549—2015 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准给出的规则制定。 附录A、附录B和附录C均为规范性附录。 本标准由辽宁医学院提出。 本标准由锦州市质量技术监督局归口。 本标准起草单位：辽宁医学院。 本标准主要起草人：田玉民、苏玉虹、朱弘焱、陶晓丽、王 希。 1  DB21/T 2549—2015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程 1范围 本标准规定了仔猪乳糖酶基因启动子和增强子多态性的检测条件、检测步骤和结果判定的技术要 求。 本标准适用于仔猪乳糖酶基因检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 27476.1-2014检测实验室安全第1部分：总则 3术语和定义 3.1 乳糖酶基因 Lactase gene, LCT 乳糖酶（LCT）又称β-半乳糖苷酶，在特定条件下将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，进而被消化道吸 收。仔猪的乳糖酶基因位于染色体15q13，预测CDS全长为5 793bp，在基因序列数据库(GenBank)中的 登录号为XM_003359430。 4防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2第七章规定执行。 5安全防护 实验室安全防护按GB/T 27476.1第五章规定执行。 6检测条件 6.1实验室条件 按GB/T19495.2中的规定执行。 6.2扩增仔猪乳糖酶基因片段的 PCR引物 2  DB21/T 2549—2015 扩增启动子 SNP G-308C和A-301G片段的PCR引物： ——上游引物F：5'-AAA AAG TTT GGT AAG GAC CT-3'； ——下游引物R：5'-GGA ACT GTT AGG AGG TAT GTG-3' 扩增增强子 SNP G-797A片段的PCR引物： ——上游引物F：5'-TAA ACA AAG CCA AGG ACA TT-3'； ——下游引物R：5'-CTG GGG TGT ATG TGC TTG TGG-3' 6.3主要试剂 用水应符合GB/T 6682的灭菌双蒸水。 裂解液、10% SDS、饱和酚、TE缓冲液、2 × Pfu PCR Master Mix、蛋白酶K、凝胶回收纯化试剂盒、 测序试剂盒等。具体配制方法参见附录A。 6.4主要仪器 微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、pH计、精度0.1 g分析天平、涡 旋混合仪、电泳仪、全自动DNA测序仪等。 7检测步骤 7.1样品的采集 用猪耳号钳子夹取仔猪耳部边缘组织0.5 cm，立即置于装有75%乙醇的1.5mL Ep白色塑料管中， 3 -20℃保存备用。 7.2仔猪基因组 DNA提取 采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录B。 7.3乳糖酶基因 5'UTR区启动子SNP G-308C和A-301G的检测 15 μL反应体系：DNA模板50 ng、10 μmol/L 上下游引物各1 μL、2 × Pfu PCR Master Mix 7.5 μL、 加灭菌双蒸水至15μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模 板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为318 bp。 PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环； 72℃延伸10min，4℃保存。 用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。 用TaKaRa MiniBESTAgarose GelDNA ExtractionKit Ver.4.0测序试剂盒对PCR产物测序反应。然后在 ABI 3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳和序列测定，获得序列色谱图ABI文件。通过Sequencing Analysis 和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。 7.4乳糖酶基因5'UTR区增强子SNP G-797A的检测 3  DB21/T 2549—2015 15 μL反应体系：DNA模板50 ng、10μmol/L 上下游引物各1 μL、2×Pfu PCR Master Mix 7.5 μL、 加灭菌双蒸水至15μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模 板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为147 bp。 PCR反应循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 S，72℃延伸30 s，30个循环； 72℃延伸 10 min；4℃保存。 用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。 用TaKaRa MiniBESTAgarose GelDNA ExtractionKit Ver.4.0测序试剂盒对PCR产物测序反应。然后在 ABI 3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳和序列测定，获得序列色谱图ABI文件。通过Sequencing Analysis 和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。 8结果判定 8.1启动子SNP G-308C和A-301G基因型判定 启动子G-308C和A-301G呈完全连锁，因此仅有2个等位基因：GA和CG。如果测序结果仅有等位基 因GA，基因型为纯合子GAGA；如果测序结果仅有等位基因CG，基因型为纯合子CGCG；如果测序结 果有两种等位基因：GA和CG，基因型为杂合子GACG。测序结果参考附录