ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2548—2015 种猪氟烷基因 PCR-RFLP检测技术规程 Method of PCR-RELP for detecting halothane genotype in swine 2015—12—15发布 2016—02—15实施 辽宁省质量技术监督局发 布  DB21/T 2548—2015 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准给出的规则制定。 附录A、附录B和附录C均为规范性附录。 本标准由辽宁医学院提出。 本标准由锦州市质量技术监督局归口。 本标准起草单位：辽宁医学院。 本标准主要起草人：苏玉虹、田玉民、朱弘焱、李立山、王立辛、王希。 1  DB21/T 2548—2015 种猪氟烷基因 PCR-RFLP检测技术规程 1范围 本标准规定了种猪氟烷基因的PCR-RFLP（聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性）检测条件、 检测步骤和结果判定的技术要求。 本标准适用于种猪氟烷基因的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 27476.1-2014检测实验室安全第1部分：总则 3术语和定义 3.1 氟烷基因halothane gene 即兰尼定受体1 (RyanodineReceptor 1,RYR1)基因，定位于猪6号染色体6p1.2，在基因序列数据库 （GenBbank）中的登录号为X69465.1，全长29 699 bp，mRNA为15 378 bp。该基因编码骨骼肌钙离子 释放通道蛋白，是猪应激综合征（Porcine Stress Syndrome, PSS）的主效基因。 4防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2第七章规定执行。 5安全防护 实验室安全防护按GB/T 27476.1第五章规定执行。 2  DB21/T 2548—2015 6检测条件 6.1实验室条件 按GB/T19495.2中的规定执行。 6.2扩增种猪氟烷基因片段的 PCR引物 ——上游引物F：5′ TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA 3′ ——下游引物R：5′ TTC ACC GGA GTG GAG TCT CTG AG 3′。 6.3主要试剂 水应符合GB/T 6682的灭菌双蒸水。 裂解液、10% SDS、饱和酚、TE缓冲液、TBE缓冲液、上样缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液、2 × Pfu PCR Master Mix、限制性内切酶Hha I及10×M酶切缓冲液、蛋白酶K、DNA分子质量标准品等。具体配 制方法参见附录A。 6.4主要仪器 微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、 精度0.1 g分析天平、恒温金属浴、涡旋混合仪。 7检测步骤 7.1样品的采集 用猪耳号钳子夹取种猪耳部边缘组织 0.5 cm3，立即置于装有 75%乙醇的 1.5 mL Ep白色塑料管中， -20℃保存备用。 7.2种猪基因组 DNA提取 采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录B。 7.3 PCR扩增及其产物检测 15 μL反应体系：0.05μg/μL～0.1 μg/μL待测DNA 1 μL、20 μmol/L 上下游引物各 1 μL、2 × PfuPCR Master Mix 7.5 μL、灭菌双蒸水 4.5 μL。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以 灭菌双蒸水为模板的 PCR反应作为阴性对照）。 PCR反应循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性 45 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，35个循环； 72℃延伸10 min；4℃保存。 取 2 μL PCR产物和2 μL DNA分子质量标准品（100bpDNA Marker），2%琼脂糖凝胶（溴化乙锭 3  DB21/T 2548—2015 （EB）溶液染色）电泳 20 min～30min（2 V/cm～3V/cm），在凝胶成像系统观察条带。PCR扩增结 果示意图见附录C中的图 C.1。 7.4 PCR产物的酶切及产物检测 取 10 μL PCR产物（阴性对照同样操作），加入0.5 μL限制性内切酶Hha I （10 U /μL）和 2 μL 10 ×M buffer，加灭菌双蒸水至 20 μL；反应条件为 37℃温度下反应3h～4h。 取 10 μL酶切产物和3 μL DNA分子质量标准品（DL2000DNA Marker），2%琼脂糖凝胶（溴化乙 锭（EB）溶液染色）电泳 20 min～30min（2 V/cm），在凝胶成像系统观察条带。酶切图谱见附录C 中的图C.2。 8结果判定 8.1正常种猪 出现 493 bp、166 bp两条电泳带，即基因型为HalNHalN，参考附录C中的图 C.2泳道3-15判定。 8.2隐性携带种猪 出现 659 bp﹑493 bp和166 bp三条电泳带，即基因型为HalNHaln，参考附录C中的图 C.2泳道 1-2 和 17判定。 8.3纯合突变种猪 出现 659 bp一条电泳带，即基因型为HalnHaln，参考附录C中的图 C.2泳道16判定。 9废弃物处理 实验过程中所产生的废弃物按 GBT 27476.1中的规定执行。 4