ICS65.150 B52 D B 32 备案号： 江 苏省地方标准 DB32/T1738—2011 草鱼出血病病毒（GCHV）逆转录—聚合酶 链式反应(RT-PCR)检测方法 Testmethodofreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR) forGrassCarpHemorrhageVirus(GCHV) 2011-04-15发布 2011-06-15实施 发布 江苏省质量技术监督局  DB32/T1738—2011 前 言 本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准化的结构和编写规则》的规定编写。 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由江苏省海洋与渔业局提出。 本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：陈辉、邹勇、李婧慧、段翠兰、方苹、刘训猛、倪金俤、王习达、陈静、陈光 芸、郭立新。 I  DB32/T1738—2011 草鱼出血病病毒（GCHV）逆转录—聚合酶 链式反应(RT-PCR)检测方法 1范围 本标准规定了细胞分离病毒后，用 PCR技术诊断草鱼出血病病毒的方法。 本标准适用于草鱼出血病病毒的分离和鉴定，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本部分。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本部分。 SC/T7103-2008水生动物产地检疫采样技术规范 GB/T15805-2008鱼类检疫方法 GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法 3试剂和材料 3.1水 应符合GB/T6682-2008中一级水的规格。用于PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用DEPC处 理以除掉RNA酶 3.2GCHV标准株 3.3Taq酶 -20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.4逆转录酶AMV 10U/mL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.5RNA抑制剂(RNasin) 20U/μL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.6dNTP(含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmoL/L) 3.7引物 试验用到的一对引物，其扩增出的片段为455bp，其序列如下： F：5’-CGCTTCGCTGTTTATGC-3’ R：5’-TTATCAGGTGCCCAGTTTT-3’ 1  DB32/T1738—2011 3.8无水乙醇 分析纯，使用前预冷到-20℃。 3.9矿物油 要求无DNA酶和RNA酶。 4器材和设备 4.196孔细胞培养板。 4.2倒置显微镜。 4.3恒温培养箱。 4.4普通冰箱和低温冰箱。 4.5组织研磨工具。 4.6离心机和离心管。 4.7PCR扩增仪。 4.8电泳仪。 4.9微量移液器及吸头。 4.10凝胶成像系统。 5GCHV病毒的分离 5.1采样 对有临床症状的鱼，如是体长小于等于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取内脏(包括肾); 体长大干6cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织。按SC/T7103-2008 采样。 5.2样品处理 应在10℃以下。先用组织研磨工具将样品组织匀浆成糊状，再按1:10的最终稀释度重悬于培养液中. 如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有100U/mL双抗（青霉素、链霉素） 的培养液中，于15℃下孵育2h-4h或4℃下孵育6h～24h,差速离心：9000r/min5min，12000r/min15min, 收集上清液。 5.3病毒分离 对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1:10,1:100和1:10003个稀释度的上清 液以适当体积分别接种到生长约24h的CIK细胞单层中，每孔(2cm)的细胞单层最多接种100μL稀释液。 2 15℃-20℃吸附0.5h～lh后，加人细胞培养液。置于24℃士1℃培养。试验中要设有阳性对照(接种GCHV 标准株)，和空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40倍到100 倍倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病 变(CPE)，应立即进行PCR鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞 进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000r/min,4 ℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检 查。如果阳性对照也未出现CPE，则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学 检查。 2  DB32/T1738—2011 6操作步骤 6.1样品处理 将450μL细胞病变悬液放人1.5ML的离心管，再加人450μLCTAB溶液(见附录A.1)并混匀，25℃作 用2h～2.5h。 6.2RNA抽提 在含有样品的塑料离心管中加人600μL抽提液1(见附录A.2)，用力混合至少30s，12000r/min离心 5min，小心取上层水相(约750μL)，再加人650μL抽提液2(见附录A.3)，用力混合至少30s,12000r/min 离心5min，小心取上层水相〔约600μL)。再加入-20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇(约900μL)，倒置 数次混匀后，-20℃8h以上沉淀核酸。14000r/min离心30min，小心弃去上清。干澡后加12μL水溶解， -80℃冻融一次，用作PCR模板。 6.3变性和退火 在PCR管中加人10μL模板和1.5μL引物R，加3.5μL水使总体积为15μL,置于90℃反应5min～10 min。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。 6.4cDNA合成 在上述反应管中继续加入：5μL的5倍逆转录酶浓缩缓冲液(见附录A.5),2μLdNTP,1μLRNA酶 抑制剂(20U),1μL逆转录酶AMV(20U)和1μL水。40℃反应60min，再95℃10min灭活。 6.5PCR扩增DNA 在上述反应管中再继续加入：10倍Taq酶用浓缩缓冲液(见附录A.7)9μL,25mmol/L的氯化镁(见附 录A.6)9μL.,dNTP2μL、引物R1μL和引物F1μL,Taq酶1μL、加水到总体积为100μL,每管加入50 μL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。按照：94℃4min→94 ℃1min→57℃1min→72℃1.5min35次循环,72℃1