犐犆犛６５．０２０．３０ 犅４４ 中华人民共和国国家标准 犌犅／犜３８７４０—２０２０ 实验动物　猴马尔堡病毒检测方法 犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔犪狀犻犿犪犾—犕犲狋犺狅犱犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狊犻犿犻犪狀犕犪狉犫狌狉犵狏犻狉狌狊（犕犃犚犞） ２０２００４２８发布２０２００８０１实施 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会发布 前　　言 　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。 本标准由全国实验动物标准化技术委员会（ＳＡＣ／ＴＣ２８１）提出并归口。 本标准起草单位：海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民 共和国成都海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国济南海关、北京脑科学与类脑研究中心、 中华人民共和国海口海关、中华人民共和国昆明海关。 本标准主要起草人：李丹丹、张体银、安微、王绥家、凌宗帅、李文龙、陈平亚、艾军。 Ⅰ 犌犅／犜３８７４０—２０２０ 实验动物　猴马尔堡病毒检测方法 １　范围 本标准规定了猴马尔堡病毒实时荧光ＲＴＰＣＲ 检测的操作方法。 本标准适用于猴马尔堡病毒的检测。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 ＧＢ／Ｔ６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ＧＢ／Ｔ１８０８８　出入境动物检疫采样 ＧＢ１９４８９　实验室　生物安全通用要求 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 ３．１ 马尔堡病毒　犕犪狉犫狌狉犵狏犻狉狌狊 一种高致病性病毒，属丝状病毒科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ），单股负链ＲＮＡ 病毒，基因组约１９．１ｋｂ，为已知的 最大的负链ＲＮＡ 病毒。 ３．２ 逆转录实时荧光聚合酶链式反应　狉犲犪犾狋犻犿犲狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲狉犲狏犲狉狊犲狋狉犪狀狊犮狉犻狆狋犻狅狀狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲 犪犮狋犻狅狀；狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚 将ｍＲＮＡ 逆转录为ｃＤＮＡ 后再作为模板进行实时荧光ＰＣＲ 扩增。ＰＣＲ 反应体系中加入一对引 物的同时加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸片段，两端分别标记一个报告荧光基团和一 个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ 特异性扩增时，犜犪狇酶 的５′３′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收 到荧光信号，实现了荧光信号的累积与ＰＣＲ 产物形成完全同步。 ３．３ 噪音　狀狅犻狊犲 荧光ＰＣＲ 仪在仅仅使用ＰＣＲ 管和水的状态下的本底荧光强度。 ３．４ 犆狋值　犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱狏犪犾狌犲 从基线到指数增长的拐点所对应的ＰＣＲ 反应循环次数。 ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件。 １ 犌犅／犜３８７４０—２０２０ ＤＥＰＣ：焦碳酸二乙酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ） ｄＮＴＰ：脱氧核苷三磷酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ） ＦＡＭ：６羧基荧光素（６ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ） ＭＡＲＶ：马尔堡病毒（Ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ） ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ） ＲＮＡ：核糖核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ） ＲＴＰＣＲ：逆转录聚合酶链式反应（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ） ＳＤＳ：十二烷基硫酸钠（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ） ＴＡＭＲＡ：６羧基四甲基若丹明（６ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ） 犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ 聚合酶（犜犪狇ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） Ｔｒｉｓ：三（羟甲基）氨基甲烷［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］ ５　试剂或材料 本标准所用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格要求。 ５．１　裂解液：Ｔｒｉｚｏｌ或其他等效裂解液。 ５．２　三氯甲烷∶异戊醇：体积比２４∶１。 ５．３　异丙醇：－２０ ℃预冷。 ５．４　磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）：见附录Ａ 中的Ａ．１。 ５．５　无ＲＮａｓｅ水：见Ａ．２。 ５．６　７５％乙醇：见Ａ．３。 ５．７　逆转录酶：－２０ ℃保存，避免温度剧烈变化。 ５．８　１０×ＲＴＰＣＲ 缓冲液。 ５．９　ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。