该研究在建立了奶牛乳腺上皮细胞体外培养方法的基础上,研究了自制培养基对 奶牛乳腺上皮细胞生物学功能的影响,分别从细胞生长曲线、细胞增殖能力、酪蛋白 基因表达及酪蛋白合成方面进行了初步探讨。该研究的目的旨在验证自制培养基是否 会对奶牛乳腺上皮细胞的生物学功能造成负面的影响,为下一步试验奠定基础。 主要研究内容与结果如下: (1)采用酶消化和乳汁分离法分别对乳腺上皮细胞进行原代培养,根据成纤维 细胞和乳腺上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同对原代培养的乳腺上皮细胞进行纯化, 并进行传代、冻存与复苏,对得到的细胞进行形态学、生长特性、免疫组织化学鉴定。 结果显示:分离得到的细胞培养后呈鹅卵石铺路石样,细胞之间连接紧密且界限清晰, 单层生长;细胞生长曲线呈S形,具有明显的潜伏期、指数生长期、平台期.细胞于 第3d进入指数生长期于第7d进入平台期,符合一般的细胞生长规律;CK-18 (细胞 角蛋白18)的免疫组化鉴定结果呈现出强阳性,说明分离得到的细胞属典型的上皮细 胞。 (2)研究了自制培养基对乳腺上皮细胞生物学功能的影响。试验采用完全随机 试验设计,对照组为DMEM/F12培养基,试验组为自制培养基。每个处理均设三个重 复,每个重复三个平行。试验结果如下:使用自制培养基的乳腺上皮细胞指数生长期 的细胞活力要明显弱于DMEM/F12培养基,但是在延迟期(接种48h)内细胞的增值活 力并不弱于DMEM/F12培养基;自制培养基在接种后48h内对乳腺上皮细胞的增殖活 力要显著高于< 0.0001) DMEM/F12培养基;与DMEM/F12培养基相比经自制培养 基处理的乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN3基因表达显著上调、P : 0.034 P: 0.015), 上调量分别达到了 3. 57倍和3. 27倍,CSN1S2、CSN2基因表达量差异不显著(户>0.05); 与DMEM/F12培养基相比,自制培养基对乳腺上皮细胞a S及P -酪蛋白的合成的影响 差异并不显著= 0.188 P = 0.548)。 关键词:奶牛乳腺上皮细胞;自制培养基;基因表达;酪蛋白 Effects of Home made-Medium on Biological Function in Primary Cultured Bovine Mammary Epithelial Cells Abstract In this experiment, the Bovine Mammary Epithelial Cells was used for the model to assay the effects of Home made-Medium on Biological Function in vitro. The study was conduct from the cell growth curve, the level of cell proliferation, mRNA Transcription of casein gene and the casein synthesis. The purpose is to exam if the Home made-Medium have negative effect on the biological function of BMEC and lay a foundation for further experiments.The content of this study and results as follows: The mammary epithelial cells were obtained with collagenase digestion and milk collection methods from healthy Chinese Holstein cattle and purified by trypsin. Pure epithelial cells were performed by passages culture、cell cryopreservation and recovery. The abtained cells were identificated by morphology, growth characteristics and immunohistochemistry.The results shows that: The growth curve conformed to the rule of ‘‘S” sigmoid curve for proliferating cells with a lag-phase, exponential phase, and steady phas. The time for cell went into exponential was at the 3rd day and steady phas at the 7th day. CK-18 immunohistochemical identification results showed a strongly positive. It confirmed that the cells were typical epithelial cells. In this experiment, the effects of Home made-Medium on biological function in BMEC were researched. A completely random design was used. The control group is DMEM/F12 medium and the treatment group is Home made-Medium. Each treatment has three replicates and each replicate has three parallel processing. The results show that: The cell activity of BMEC which treated with Home made-Medium has significantly lower than DMEM/F12, but during the period of lag-phase, the activity of BMEC as the same as DMEM/F12 medium. The proliferation of BMEC which treated with Home made-Medium has significantly higher than DMEM/F12 medium (P < 0.0001). The Home made-Medium increased CSN1S1 and CSN3 genes expression significantly (P = 0.034 P=0.015) than DMEM/F12 medium, and CSN1S1 and CSN3 genes expression were increased more than 3.57-fold and 3.27-fold. Compare DMEM/F12 medium with Home made-medium the content of a s-casein and P-casein have no signiflcant(P =0.188 P=0.548). Key words: Bovine Mammary Epithelial Cells ; Home made-Medium; Gene expression; Casein Directed by: Prof. Ao Changj in Applicant for Master degree: Cao Qi.Ma. (Animal Nutrition and Feed Scicnce) (College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018,China) 弓^ 1 1.1动物细胞体外培养研究进展 1 1.2乳腺细胞的研究进展 1 1.2.1乳腺上皮细胞培养方法的研究进展 1 1.2.2牛乳腺上皮细胞系的研究进展 2 1.2.3牛乳腺上皮细胞的鉴定 4 1.2.4细胞培养所用培养基的简介 1.3研究思路与研究内容 1. 3. 1 石开究思路 1.3.2研究内容 试验部分 2. 1奶牛乳腺上皮细胞原代培养及鉴定 2.1.1 试验材料 2.1.2 试验方法 2.1.3 试验结果 2.1.4 讨论 2.1.5 小结 2. 2自制培养基对乳腺上皮细胞生物学功能的影响 2.2.1 试验材料 2.2.2试验方法 2.2.3数据处理 2.2.4 结果与分析 2.2.5讨论 2.2.6 小结 报告总体讨论与结论 3.1 报告总体讨论 3.2报告结论 报告创新点 有待于进一步解决的问题 il! 缩略语表 AA (Amino acids) 気細 BMEC (Bovine mammary epithelial cell) 奶牛乳腺上皮细胞 CSN1S1 (a srcasein) asr酪蛋白 CSN1S2 (a s2-casein) 酪蛋白 CSN2 (p - casein) P-酪蛋白 CSN3 (Y -casein) K酪蛋白 DMSO (dimethylsulphoxide ) 二甲基亚砜 PBS (Phosphate buffered saline) 磷酸盐缓沖液 EDTA (Ethylene diaminetetra-acetic acid) 乙二胺四乙酸 内蒙古农业大学硕士学位报告 1_ 1引言 1.1动物细胞体外培养研究进展 动物细胞培养始于上世纪初,由胚胎学衍生而来。1885年WRoux尝试把鸡胚 的神经板放在温热的盐水中竟成功地维持存活了若干天,被认为是体外组织培养的 萌芽。1907年,洛克菲勒研究所的Harrison为了研究生活状态的神经纤维,用淋 巴液和无菌盖片法将青蛙胚胎组织培养了四个星期。该研究所的Carrel为了改进 体外培养系统,用鸡胚心肌组织做了实验,他利用一种设备使鸡胚心肌组织在体外 存活了数年之久,标志着组织培养技术的诞生,表明了利用体外存活组织进行实验 的可能性“。1981年,Evans和Kaufman对小鼠畸胎瘤细胞体外培养做了研究,象 征着胚胎干细胞体外培养技术的诞生真正幵创大规模细胞培养是在20世纪40 年代Earle和Dulbecco设计了细胞培养液配方,并且将细胞分散成单个细胞进行 悬液培养。此后,随着培养基、培养装置以及培养方法的不断改进,动物细胞培养 的研究及应用逐步增多和深入,发展至今已成为在医学、生物研究中广泛采用的技 术方法。细胞培养大致可分为两种:一是群体培养,即将含有一定数量细胞的悬液 置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,汇合后形成均匀的单细胞细胞层。二是克隆培养, 即将高度稀释的细胞悬液加入培养瓶中,各个细胞贴壁后,彼此距离较远。经生长 增殖后每个细胞形成一个细胞群落,称之为克隆。细胞培养中,培养液也是关键, 必须考虑以下因素,即细胞生长所需的营养成分、适当的渗透压、PH值、细胞生长 因子等力。动物细胞体外培养技术不但能够分离纯化组织中不同类型的细胞,而且 能够在体外进行大规模的增殖和传代,为正常细胞和非正常细胞生理代谢的比较提 供了非常有效的研究途径,同时也为细胞培养工业化应用奠定了基础。动物细胞培 养的突出优点主要有两方面,一方面便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生 长发育和分化等的影响;一方面是便于对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长 及发育等过程的观察。被广泛地应用于生物学的各个领域,如细胞生物学、分子生 物学、免疫学、遗传学、肿瘤学等。 1.2乳腺细胞的研究进展 1.2.1乳腺上皮细胞培养方法的研究进展 乳腺是哺乳动物所特有的具有泌乳功能的特殊腺体,乳腺细胞是研究基础原理 的理想试验模型。体外培养体系模拟体内环境来控制细胞生长,可以研究单一物质 对细胞的影响,而不受动物个体的影响,因而,是一种快捷、有效的研究手段,近 年来得到了广泛的应用[41。乳腺上皮细胞体外培养的方法主要有组织块法、酶消化 法、机械破碎法和乳汁分离法。 1957年,Lasfargues等首先利用胶原酶消化法将乳腺细胞从乳腺组织中分离 2 自制培养基对奶牛乳腺上皮细胞生物学功能影晌的研究 出來,第一次实现了乳腺细胞的直接培养。 1961年,Ebmer等首次在体外长期培养了牛乳腺细胞,培养时同样采用胶原酶 分离细胞,幵始培养上皮细胞的比例很大,而且与成纤维细胞形成类似乳腺组织的 二维空间结构,即存在组织能力(Organizational ability)。随着传代的不断进行,乳 腺上皮细胞逐渐被生长较快的成纤维细胞所取代,并失去了原有的组织能力。1985 年,McGrath为了解决成纤维细胞过度增殖的问题,将含有乳腺上皮细胞的胶原酶 消化液进行密度梯度离心,这样便去除了消化液中的成纤维细胞、脂肪颗粒、细胞 碎片、DNA纤维等成分。 1984年,Danielson等在建立小鼠乳腺细胞系COMMA-ID过程中,利用胰蛋白 酶/EDTA (Trypsin/EDTA)溶液多次处理上皮细胞单层,除去不断生长的成纤维细 胞。但这种方法很难完全去除成纤维细胞,需结合其他蹄选方法tHi。 1989年,Chaslam等想要通过细胞克隆得到纯的乳腺上皮细胞。但正常的乳腺 上皮细胞的克隆率比较低,要获得上皮细胞的单克隆